黎妍妍，王 林，彭五星，李锡宏*

（1.湖北省烟草科学研究院，武汉 430030；2.湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430040；3.恩施州烟草公司宣恩县烟叶分公司，湖北 宣恩 445504）

根际是植物-土壤-微生物相互作用的关键微域，每克根际土壤中大约有109个微生物定殖[1]。在自然界中，植物会在其根际土壤中积累病原体，这最终会影响土壤特性[2]，造成的根际土壤微生物群落结构的变化又会引起土壤中物质和能量循环、有机质分解与合成等方面的改变[3]。因此，深入认识土传病害发生过程中根际土壤微生物的变化对于明确根际土壤微生物与土传病害的互作关系具有重要意义。

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种土传细菌性病害，每年给烟叶生产造成巨大的产量损失和经济损失[4]。以往研究通过分析健康烟田和发病烟田之间土壤微生物群落结构差异，探索了微生物与烟草青枯病之间的关系[5-7]，但关于青枯病发生过程中根际土壤微生物的变化情况鲜有报道。本研究旨在通过扩增子测序技术，探究烟草青枯病不同发病阶段根际土壤微生物群落特征，以期为进一步明确根际土壤微生物群落与青枯病的互作关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

2017 年在湖北省恩施州宣恩县椒园乡凉风村设置3 个烟草青枯病系统调查点（即3 次重复），每个系统调查点面积为132 m2。调查田块土壤类型为黄棕壤，土壤肥力中等，海拔约900 m，连年种植烟草，烟草青枯病发生严重。种植烟草品种为云烟87，移栽期为4 月25 日前后，整个烟草生育期内不施用防治烟草病害的药物。

1.2 烟草青枯病病情调查

以株为单位，按照国家标准 GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》记载每株烟青枯病发病严重度，计算发病率和病情指数。发病率=发病株数/调查总株数×100%；病情指数=。

1.3 烟株根际土壤样品采集

于烤烟移栽前（0 d），采用5 点取样法采集各田块10～25 cm 深的耕层土壤样品，混合为一个样品，记作C_0 d。采用同样的取样方法，于烤烟移栽后50、75 和100 d 采集烟株根际土壤样品[与根系结合较紧密的土壤（4 mm 内）]，混合后分别记作C_50 d、C_75 d 和C_100 d。每个土样3 次重复，共计12 个土样。土样混匀后，将其置于干冰中带回实验室，保存于-80 ℃冰箱中用于DNA 提取。

1.4 土壤微生物群落分析

1.4.1 DNA 提取和PCR 扩增 利用FastDNA Spin Kit 试剂盒（MP Biomedicals,USA）提取土壤总DNA。分别用515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物对细菌16S rDNA V4 可变区进行PCR 扩增；用ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG G-3′）和ITS2-2043R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGA TGC-3′）引物对真菌ITS1 区进行PCR 扩增。扩增体系为30 μL：15 μL Phusion Master Mix Buffer（2×）、3 μL 引物（2 μmol/L）、10 μL DNA（1 ng/μL）模板和2 μL ddH2O。反应程序为：98 ℃ 1 min；98 ℃10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（30 个循环）；72 ℃5 min（Bio-rad T100 梯度PCR 仪）。PCR 产物经2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测合格后，进行文库构建，使用Illumina Hiseq PE250 测序平台进行上机测序（诺禾致源生物信息科技有限公司）。

1.4.2 OTU 聚类与物种注释 利用Uparse 软件对所有样品的Effective Tags 进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTUs。对OTUs 代表序列进行物种注释，用Mothur 方法与SILVA 的SSUrRNA数据库进行细菌物种注释分析，用QIIME 软件中的blast 方法与Unit 数据库进行真菌物种注释分析，获得各分类水平上的群落组成。

1.5 数据处理

利用QIIME 软件计算α 多样性指数（Sobs、Chao1 丰富度指数和Shannon 多样性指数）。用SPSS 22.0 分析烟草青枯病发生情况和微生物群落OTU数量、α 多样性指数、物种相对丰度等在各样本间的差异（p＜0.05 水平）（One-way ANOVA）；根据样品在属水平的物种注释及丰度信息，对相对丰度前30 位的细菌属和真菌属的相对丰度进行标准化处理，得到标准化值（样品在该分类上的相对丰度和所有样品在该分类的平均相对丰度的差除以所有样品在该分类上的标准差所得到的值，即Z值），然后采用HemI 软件绘制Heatmap 图。

2 结果

2.1 烟草青枯病发生情况

对烟草青枯病发生情况进行了调查与分析（图1）。结果表明，烤烟移栽后100 d 时，烟草青枯病发病率为97.78%，显著高于移栽后50 d（22.78%）和75 d（29.44%）的发病率；烟草青枯病病情指数为37.41，显著高于移栽后50 d（3.27）和75 d（5.37）的病情指数。

2.2 土壤微生物群落多样性分析

对根际土壤细菌和真菌群落α 多样性指数进行了差异分析（表1）。结果表明，土壤细菌群落多样性和丰富度整体呈现出逐渐降低的趋势；C_100 d的土壤细菌群落Sobs、shannon、chao1 指数和OTUs数量分别较C_0 d 降低了17.52%、8.00%、17.89%和16.11%，且Sobs 和shannon 指数均显著低于其他样本，OTUs 数量显著低于C_50 d 和C_0 d。土壤真菌群落Sobs、shannon、chao1 指数和OTUs 数量在各样本间不存在显著差异，但C_50 d 样本的Sobs、chao1 指数和OTUs 数量均低于其他样本，这3 个指标分别较C_0 d 降低了15.28%、18.25%和15.49%。以上结果表明烟草青枯病发生对土壤细菌群落多样性和丰富度的影响较大。

图1 烤烟移栽后不同时期烟草青枯病发生情况Fig.1 The occurrence of tobacco bacterial wilt at different periods post-transplantation

2.3 根际土壤细菌群落结构特征

2.3.1 细菌群落在门水平上的组成 平均相对丰度＞1%的细菌门共有10 个（表2），分别为变形菌门（Proteobacteria,35.69%～51.12%）、放线菌门（Actinobacteria,6.69%～18.71%）、酸杆菌门（Acidobacteria,7.81%～18.39%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes,5.36%～8.67%）、厚壁菌门（Firmicutes,0.76%～5.96%）、拟杆菌门（Bacteroidetes,2.85%～4.94%）、绿弯菌门（Chloroflexi,4.83%～6.72%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae,1.17%～3.94%）、浮霉菌门（Planctomycetes,0.88%～3.53%）和疣微菌门（Verrucomicrobia,1.19%～3.82%）。

表1 土壤微生物群落多样性和丰富度指数Table1 The diversity and richness indexes of soil bacteria and fungi in rhizosphere soil

在10 个细菌门中，有6 个细菌门的相对丰度在各样本间存在显著差异。土壤中Acidobacteria、Nitrospirae 和Verrucomicrobia 的相对丰度随青枯病病情发展逐渐降低，且C_75 d 和C_100 d 显著低于C_0 d；与C_0 d 相比，C_75 d 降低幅度分别为47.74%、59.39%和59.42%，C_100 d 降低幅度分别为57.73%、70.30%和68.85%。Proteobacteria 的相对丰度则随青枯病病情发展逐渐升高，且以C_100 d显著高于C_0 d、C_50 d 和C_75 d，增加幅度分别为43.23%、35.27%和16.90%。Actinobacteria 的相对丰度以C_75 d 和C_100 d 显著高于C_0 d，增加幅度分别为179.67%和125.71%。Firmicutes 的相对丰度则以C_50 d 和C_100 d 显著高于C_0 d。以上结果表明烟草青枯病发生阶段（C_50 d、C_75 d 和C_100 d）与烤烟移栽前（C_0 d）土壤细菌群落存在较大差异（表2）。

2.3.2 细菌群落在属水平上的组成 对土壤样本中前30 个细菌属相对丰度的相似性进行了HEMI聚类分析（图2）。结果表明，C_0 d 与C_50 d 具有相似的细菌群落结构，聚为一类；C_75 d 与C_100 d具有相似的细菌群落结构，聚为一类。30 个细菌属可以分为4 组（I、II、III 和IV）。烤烟移栽前（C_0 d），土壤中IV 组细菌属丰度较高，Z值为1.33±0.24，主要包含H16等6 个菌属；移栽50 d（C_50 d）时，土壤中III 组细菌属丰度较高，Z值为1.50±0.00，主要包含Blautia等6 个菌属；移栽75 d（C_75 d）时，土壤中I 组细菌属丰度较高，Z值为1.34±0.20，主要包含Ralstonia、Massilia、Blastococcus、Gemmatimonas等7 个菌属；移栽100 d（C_100 d）时，土壤中II 组细菌属丰度较高，Z值为1.09±0.40，主要包含Sphingomonas、Pseudomonas、Pseudoxanthomonas、Bradyrhizobium、Roseiflexus、Lysobacter和Streptomyces等11 个菌属。

2.4 根际土壤真菌群落结构特征

3 讨 论

在清江流域烟区，烟草青枯病在病程上可划分为病害首发期、迅速蔓延期和全面爆发期，分别对应于烤烟移栽后45～67 d、67～97 d 和移栽后97 d至采收结束[8]。本研究运用扩增子测序技术探究了烟草青枯病不同发病阶段根际土壤细菌和真菌群落的结构变化，对于明确根际土壤微生物群落与青枯病的互作关系具有重要意义。由微生物多样性分析结果可知，烤烟移栽75 d 和100 d 时烟株根际土壤细菌群落Sobs、shannon 指数和OTUs 数量显著降低，这与WEI 等[9]研究结果一致；而真菌群落多样性指数无显著变化。以往研究认为，在土壤微生物中，细菌群落多样性是评价生态系统平衡和生态功能的重要因子[10]。因此，随着烟草青枯病的流行与蔓延，土壤细菌群落趋向单一化，不利于土壤中微生物种群的平衡[11-12]。

门水平上，根际土壤细菌丰度和结构在烤烟移栽 50 d 和 75 d 发生了明显的动态变化，Proteobacteria、Actinobacteria 和Firmicutes 的相对丰度显著升高，Acidobacteria、Nitrospirae 和Verrucomicrobia 的相对丰度显著降低。与细菌群落相比，门水平上根际土壤真菌群落变化较小，仅Zygomycota 的相对丰度在烤烟移栽75 d 显著升高。

与移栽前相比，属水平上根际土壤细菌群落结构于烤烟移栽后75 d 和100 d、真菌群落结构于烤烟移栽后50 d 和75 d 发生明显变化。从功能上讲，根际土壤微生物中包含致病微生物、有益微生物等[13]。致病微生物在根际土壤中定殖，努力突破保护性微生物屏障，克服植物固有的防御机制，从而导致病害发生。通过对属水平上土壤微生物群落分析发现，致病细菌Ralstonia和致病真菌Fusarium的相对丰度在青枯病发生时明显升高。本研究中，雷尔氏菌属Ralstonia仅包含青枯雷尔氏菌R.solanacearum一个种。青枯菌是导致青枯病发生的病原菌，在10种重要的植物病原细菌中，青枯菌位居第2 位[14]。青枯菌相对丰度于烤烟移栽后75 d 达到峰值，这可能与烤烟移栽后，其根系分泌的延胡索酸、肉豆蔻酸、肉桂酸、苹果酸和草酸等有机酸促进了青枯菌在烟株根部的定殖[15-16]有关；但随着青枯病的发生，根系活力减弱，分泌有机酸的能力也降低。镰刀菌属Fusarium可引起多种植物的萎蔫、根腐[17]，其相对丰度随烟草青枯病病情发展而逐渐升高，于烤烟移栽后100 d 时达到峰值。Fusarium可破坏烟株根部，为青枯菌侵染烟株制造天然的入口[18]。

除了致病微生物外，有益微生物也是根际土壤微生物中重要的一类，且研究较多。它们通过刺激植物根生长、进行根际修复、调控非生物胁迫和控制病害等促进植物生长[13]。在受到病原菌侵染时，植株通常能够调节根际土壤微生物群落，特异性地招募具有诱导抗病和促进植物生长的有益微生物[19]。本研究结果也证实了这一点。与烤烟移栽前相比，对土传病原菌具有拮抗作用或对植物生长具有促生作用的Sphingomonas、Gemmatimonas、Pseudomonas、Lysobacter、Streptomyces等有益细菌[20-24]和Trichoderma、Gibberella、Chaetomium等有益真菌[25-27]的相对丰度在青枯病发生阶段明显升高，表明青枯菌在根际和根系的入侵可能与对植物无害甚至有益的某些功能菌具有正相关[28]。

4 结 论

本研究结果表明，青枯病烟田根际土壤细菌群落Sobs、shannon 指数和OTUs 数量于烤烟移栽后75 d 和100 d 显著降低，真菌群落多样性指数无显著变化。与烤烟移栽前相比，属水平上根际土壤细菌群落结构于烤烟移栽后75 d 和100 d、真菌群落结构于烤烟移栽后50 d 和75 d 发生明显变化。致病微生物（Ralstonia、Fusarium等）和有益微生物（Sphingomonas、Gemmatimonas、Pseudomonas、Lysobacter、Streptomyces、Trichoderma、Gibberella、Chaetomium等）的相对丰度在青枯病发生阶段明显升高。