涂冬萍 王柳萍 赵立春 黄志其 翟勇进 白隆华 莫长明

摘 要：該文基于不膨大和膨大的牛大力根的转录组测序结果，采用生物信息学技术对筛选到的28 个牛大力淀粉酶基因进行分析。结果表明：28 个牛大力淀粉酶相关蛋白基因编码的氨基酸序列分子量为20.78～349.39 KDa;均为酸性蛋白部分;部分亚细胞定位在叶绿体;具有PLN02784 super family、AmyAc-family super family结构域;二级结构中除MsAm1、MsAm7、MsAm8、MsAm15、MsAm16、MsAm22、MsAm23、MsAm28中α螺旋占比最大外，无规则卷曲的比例最大;三级结构预测具有α淀粉酶结构、β淀粉酶结构、异淀粉酶结构等;淀粉酶基因家族共有86 个作用元件，MsAm9的作用元件最多（42 个）;系统发育树表明MsAm15、MsAm16归于1 类，且均具有motif 2、motif 3、motif 7，MsAm4、MsAm24、MsAm26归于1 类，与拟南芥淀粉酶进行比对，AtBM4和MsAm6归为一类，AtAM2和MsAm2归为一类，AtBM8和MsAm5归为一类，AtBM4和MsAm6归为一类，AtAM10和MsAm22归为一类，AtIM3和MsAm17归为一类。这些分析结果可为今后深入研究28 个牛大力淀粉酶的生物学功能和调控机制提供一定的理论依据，为牛大力根部膨大的研究及品种的改良提供参考。

关键词：牛大力，转录组，淀粉酶基因家族，理化特性

中图分类号：Q949

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2020）09-1288-12

Abstract：In order to lay the foundation for revealing the growth and development law and screening the genes related to root expansion by studying the biological activity of the amylase gene family of Millettia speciosa. Based on the transcriptome sequencing results of non-enlarged and enlarged root of M. speciosa，28 daphnia magna amylase genes were screened by bioinformatics technology. The results showed that the molecular weights of amino acid sequences encoded by 28 amylase-related protein genes ranged from 20.78 to 349.39 KDa. They were all acidic proteins，some of the subcellular localization was in chloroplast. They had PLN02784 super family and AmyAc-family super family conserved domains. The proportion of random coil in the secondary structure was the largest excluded from MsAm1，MsAm7，MsAm8，MsAm15，MsAm16，MsAm22，MsAm23 and MsAm28. Tertiary structure prediction showed that the amylase of M. speciosa contained α-amylase structure，β-amylase structure，and isoamylase structure. Amylase gene family had 86 functional elements，and MsAm9 had the most functional elements （42）. The phylogenetic tree showed that MsAm15，MsAm16 belonged to the same category and had motif 2，motif 3，motif 7，and MsAm4，MsAm24，MsAm26 belonged to the other same category. Compared to Arabidopsis thaliana anylase，AtBM4 and MsAm6，AtAM2 and MsAm2，AtBM8 and MsAm5，AtBM4 and MsAm6，AtAM10 and MsAm22，AtIM3 and MsAm17 belonged to the same category，respectively. These results could provide a theoretical basis for the further study of biological functions and regulation mechanism of 28 M. speciosa amylase，and provide a reference for the study of root enlargement and improvement of M. speciosa amylase varieties.

Key words：Millettia speciosa，transcription group，amylase gene family，physicochemical characteristics

牛大力为豆科蝶形花亚科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millettia speciosa）的干燥根。味甘性平，具补虚润肺、强筋活络之效，临床上对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺结核、慢性支气管炎等慢性疾病有一定疗效（全国中草药汇编编写组，1986）。主要分布于福建、湖南、广东、广西、海南、贵州等地，是两广地区著名的补骨强筋中药，常用于制作药膳、药酒等（广西壮族自治区卫生厅，1992;广东省食品药品监督管理局，2004;南京中医药大学，2005;刘丹丹等，2009;韦翠萍等，2009;韦玉燕等，2010），为岭南地区著名的药食两用植物。现代实验研究表明，牛大力具有提高免疫功能、保肝、祛痰、镇咳、平喘、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用（周添农等，2009;王呈文等，2013;罗轩等，2014;黄翔等，2014;陈蓉蓉等，2014）。随着牛大力的深入开发利用，除了加工成中成药外，鲜品制作药膳的需求迅速增长，以致价格不断攀升。1999 年牛大力干品在产地收购价为每kg 5～6 元，2007 年牛大力鲜品产地收购价已升至 每kg 20元，到2012 年品质较好的上等鲜品收购价已暴涨至每kg 80～100 元，但目前市场无大宗货源（伍家豪，2014）。

近年来，随着野生资源的减少，牛大力种植产业显示出了广阔的发展前景。但目前牛大力栽培中遇到了根不膨大，无法结薯的难题，影响了药材的产量和质量。经过调查发现，同一个植株的牛大力不同的根性状差异显著，结薯能力不同。目前还未见牛大力根膨大的分子机理的确切研究和报道。现有研究发现基因的表达显著影响了植物膨大根的膨大，其中与木质素和淀粉合成及代谢相关的基因变化明显（Gui et al.，2011;Wang et al.，2016）。据报道，在紫薯储藏根中，膨大的根淀粉含量下降，β-淀粉酶活明显提高，淀粉降解加速。研究表明，淀粉酶的活性与储藏根发育存在一定的关系。本研究基于牛大力根系转录组测序数据，对筛选出的淀粉酶基因家族成员进行生物信息学分析，为今后研究及阐释淀粉酶对牛大力根膨大及贮藏的分子机理提供参考，为牛大力膨大根优良品种的选育

及将来转基因培育牛大力等后期基因工程研究提供理论依据和基因资源。

1 材料与方法

1.1 材料

牛大力植株采集于广西百色市那坡，经广西药用植物园白隆华研究员鉴定为豆科美丽崖豆藤（Millettia speciosa）的干燥根，两年生。取同一个植株中膨大根（肉质明显，较软，易折断，较脆，直径大于2.5 cm）和不膨大根（肉质不明显，纤维性大，较硬，不易折断，直径小于1 cm），以该牛大力膨大根和不膨大根植物材料进行转录组测序。

1.2 方法

由武汉华大医学检验所有限公司在Illumina hiSq2500平台对牛大力膨大根和不膨大根进行转录组测序并进行序列分析。

基于牛大力根的转录组测序数据及其注释结果，将搜索到的注释为淀粉酶的unigene通过开放阅读框ORF Finder和预测保守域CDS Search在线软件检测确认（图1）。使用ExPAsy软件对牛大力淀粉酶基因编码的氨基酸序列的理化特性进行在线预测，并进行跨膜结构域预测（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）。

使用SignalP-5.0及TargetP 1.1 Server分别对 28 条牛大力淀粉酶序列进行信号肽预测和亚细胞定位。使用SWISS-MODEL在线工具分别对牛大力淀粉酶进行二级结构预测及三级结构建模。使用PlantCARE （Lescot et al.，2002）对基因的顺式调控元件、增强子和抑制子等进行分析。基于淀粉酶的氨基酸序列，采用MEGA7.0邻接法（Neighbor-joining），构建牛大力淀粉酶系统进化树（bootstrap=1 000）。利用MEME在线工具对牛大力淀粉酶基因编码的氨基酸序列motif进行分析。

2 结果与分析

经转录组测序及分析，从转录组数据中筛选出28个淀粉酶，其碱基序列可扫描二维码（图2）。

2.1牛大力淀粉酶基因家族成员的一级结构预测

2.1.1 牛大力淀粉酶基因家族成员的鉴定与理化性质分析 基于牛大力根系转录组测序结果，搜索到注释为淀粉酶基因的unigene共有28条，然后分别经ORF Finder 和CDS Search确认具有完整开放阅读框ORF，最后共鉴定到28条牛大力淀粉酶unigene，命名为MsAm1到MsAm28（表1），ORF Finder在线预测其编码的淀粉酶前体氨基酸数目最少的为MsAm28（256 个），最大的为MsAm12（4 141个）。 利用ExPAsy在线软件对牛大力淀粉酶基因编码的蛋白质进行理化性质预测结果见表1，牛大力淀粉酶的分子量在20.78～349.39 kDa之间，均为酸性蛋白质，带正电残基（Arg+Lys）和带负电残基（Asp+Glu）均为0;不稳定系数显示MsAm1、MsAm8、MsAm15、MsAm16、MsAm18、MsAm21、MsAm25、MsAm27、MsAm28为稳定蛋白，其余为不稳定蛋白;总平均亲水性及脂肪指数显示该家族蛋白均属于亲水性蛋白。

2.1.2 牛大力淀粉酶基因序列预测 使用PlantCARE对基因的顺式调控元件、增强子和抑制子等进行分析发现，该淀粉酶基因家族共有86个作用元件（图3），MsAm9的作用元件最多（42個），其次是MsAm10（41个），MsAm28的作用元件最少（7个）。28个淀粉酶中 均含有Unnamed__4作用元件，其次除了MsAm11外，均含有CAAT-box;除了MsAm1外，均含有STRE 。其次含量丰富的是MYB，除 MsAm8和MsAm28均含有，接下来依次为 MYC，ARE，MBS，as-1，MYB-like sequence，Unnamed__1，TGACG-motif等。

此外，淀粉酶的表达除了与根膨大有一定关系外，还具有广泛的生物活性。α-淀粉酶能切割淀粉、糖原或多糖的内部α-1，4 糖苷键，产生短链糊精、寡糖、葡萄糖和麦芽糖等产物，该过程使淀粉黏度迅速降低。α-淀粉酶可以从植物、动物或微生物中获得，不同来源的α-淀粉酶功能相似，但在最适温度、pH等应用条件上有差异（李文钊等，2017）。刘晓丹等（2017）发现淀粉酶能显着降低小麦的糊化特性，从而降低了小麦的品质。萝卜因富含淀粉酶成为一种超低热量的蔬菜，且对胃部粘膜的修复具有很好的促进作用，能够防止胃酸过多、胃炎及胃溃疡，同时能够增强消化机能（任喜波等，2012）。β-淀粉酶可能通过促进叶片与角果皮淀粉分解而加强光合产物向籽粒的运输强度，并参与油菜种子中淀粉的调控（靳舒荣等，2019），且 β-淀粉酶影响着糙米的发芽（陶澍等，2018）。因此，研究植物中淀粉酶也将为植物的生长发育及物质的转换等机理的阐释提供科学参考，为将来基因工程育种提供科学依据。

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（责任编辑 周翠鸣）