林清凡，杨维群，温扬敏，罗彩林

（泉州医学高等专科学校，福建泉州 362011）

大米草是沿海滩涂禾本科植物，于1963年引入我国并在福建省过度繁殖，对福建省沿海生态造成巨大破坏[1]。近年来研究显示，大米草含有丰富的黄酮类活性物质[2]，而植物黄酮是中草药抗癌方剂的有效成分[3]，对肿瘤细胞生长增殖和侵袭转移等过程起显著作用[4]。罗彩林等[5]已在前期研究中发现，大米草黄酮（DMC-fla）具有对肝癌细胞增殖的抑制作用，现转入对食管癌作用的研究。

我国为食管癌大国，90%以上为鳞状细胞癌，福建省更是其高发病率、死亡率集中地区，高于全国平均水平[6]。食管癌细胞的高侵袭转移性引发肿瘤的复发和转移[7]，目前，已有少量研究开始探索植物黄酮对食管癌细胞侵袭能力的抑制作用[8-9]。但由于癌转移是一个涉及多基因、多信号转导通路参与的网络调控过程，目前在作用的分子水平机制的解释上较单薄。但随RNA-seq和MicroRNA测序技术的普及，两项技术已在癌与癌旁组织的表达谱比对中提供了大量靶点基因与分子病理学机制解释，最近转入到天然产物对食管癌抑制功效的分子机制解答中。

因此，本文应用RNA-seq与MicroRNA测序技术筛选大米草黄酮影响人食管癌细胞侵袭转移的相关靶点，从转录组和miRNAs水平上为阐明大米草黄酮影响食管癌转移的作用机制提供理论依据，进而探索将大米草黄酮作为食管癌治疗药物的可能性，开发生态药用价值，实现“开发资源、变废为宝”的入侵物种防治新策略[10]。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人食管鳞癌细胞株EC9706，购自北纳生物细胞库；Mareigel胶，美国BD公司；Transwell小室，美国Costar公司；RPMI1640培养基、胎牛血清FBS、PBS、胰酶（含EDTA）、RNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、miRNA反转录试剂盒和qPCR试剂盒，北京全式金生物有限公司。大米草黄酮提取液由泉州医学高等专科学校天然产物研究中心制取[11]。K5600分光光度计，凯奥科技；ABlQ3型荧光定量PCR仪

1.2 CCK-8实验检测EC9706细胞增殖反应

对数期EC9706接种于96孔板中，每孔5×103个/100 μL，加入终浓度 4 mg/mL、8 mg/mL、12 mg/mL、16 mg/mL、20 mg/mL剂量的大米草黄酮提取液（DMC-fla），并设置阴性组与环磷酰胺（CTX）阳性组，37 ℃、5% CO2下培养24 h、48 h和72 h后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育1～2 h后在450 nm波长处检测各孔吸光值A，每个剂量组设6个平行孔，取6孔平均值。

1.3 细胞划痕愈合实验

EC9706细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板，常规培养24 h后待铺满板底时，10 μL枪头于孔中划一字型划痕。实验组加入终浓度为10 mg/mL的DMC-fla后培养24 h和48 h，显微镜下（10×10倍）记录细胞迁移后的划痕宽度并拍照，3组细胞实验重复3次。

1.4 Transwell穿透测定细胞侵袭能力

Mareigel胶用RPMI1640稀释包被于Transwell小室滤膜上。取对数期EC9706细胞，RPMI1640稀释，按5×104个/孔接种于上室，下室为含10%的FBSRPMI1640，常规培养12 h后，实验组加入终浓度为10 mg/mL的DMC-fla继续培养24 h。去除Mareigel胶和滤膜上方细胞，DAPI染色，镜下（10×10倍）计数5视野中下室的细胞平均数，两组细胞实验重复5次。

1.5 RNA-seq、MicroRNA测序及差异基因分析

EC9706细胞接种于T25培养瓶至汇合度为 80%～90%、10 mg/mL的 DMC-fla处 理 24 h的EC9706细胞三组与常规培养24 h三组对照，刮取细胞后加入1 mL Trizol，液氮速冻后干冰运送至杭州联川生物有限公司进行RNA-seq。转录组数据预处理后，选取FDR值＜0.05及差异值＞4或＜-4作为显著性阈值，并以P值与Q值＜0.05为置信，得到差异表达候选靶基因。

1.6 Real-time qPCR验证所筛选的靶基因

取DMC-fla处理组与对照组的EC9706细胞各3组为样本，分别提取细胞总RNA与MicroRNA，分光光度计检测RNA和miRNA纯度和浓度，OD260/230在1.75～2.10。按照反转录试剂盒说明书合成一链cDNA为qPCR模板，按照qPCR试剂盒说明书于荧光定量PCR仪上对候选靶基因ITGB6、Serpine1和miR-205进行qPCR扩增。采用GAPDH为基因表达内参，U6为MicroRNA表达参照，SYBRGreen荧光染料法相对定量，2-ΔΔCT法计算差异表达倍数以验证转录组测序所筛选出的候选靶基因，每样本重复3次。qPCR反应引物设计如表1所示。

表1 靶基因和内参基因qPCR引物信息表

1.7 统计学分析

采用Graphpad Prism 6.0做双样本t检验和双因素方差检验等统计分析，数据使用±s表示，P＜0.05注*标记统计学意义。MeV4.9软件绘制热图。

2 结果与分析

2.1 大米草黄酮对EC9706细胞增殖活力的影响

CCK-8结果如图1显示，与对照组相比，EC9706细胞活力呈DMC-fla浓度依赖与时间依赖性的降低。与CTX组相比，在8 mg/mL和24 h处理后出现显著性差异，选择10 mg/mL浓度和24 h时长，进行后续侵袭力实验和测序的细胞处理。

图1 EC9706细胞在大米草黄酮作用下增殖活力的CCK-8结果

2.2 细胞划痕愈合实验结果

在10 mg/mL DMC-fla作 用24 h和48 h后，EC9706细胞迁移量明显小于正常培养的对照组，具显著性差异（图2）。在作用48 h后，细胞开始出现大片脱离培养基底的现象，受到明显的生长抑制。

2.3 大米草黄酮对EC9706细胞侵袭力的影响

如表2所示，EC9706细胞经10 mg/mL DMC-fla处理后，体外侵袭Mareigel胶基底能力降低，穿膜细胞数量明显减少，差异具有统计学意义，表明大米草黄酮对EC9706细胞侵袭能力具有抑制作用。

图2 EC9706细胞在大米草黄酮作用下划痕实验结果

2.4 差异性表达靶点的筛选

共筛选得到了45个满足差异阈值（FDR＜0.05，|logFC|＞2，P值与Q值＜0.05，FRKM＞5）的基因位点，相比对照（NC）组，在DMC-fla作用下，共有21个上调基因，24个下调基因（图3A）。miRNAs共筛选出13个位点，其中2个上调，11个下调（图3B）。结合目前已有研究中报道的具有食管癌指标性意义的靶基因位点，筛选出ITGB6、SERPINE1和miR-205三个候选靶基因位点。相比对照组的FPKM值，DMC-fla组中ITGB6下调11.1倍，SERPINE1下调5.3倍，miR-205下调2.7倍。

表2 10 mg/mL大米草黄酮处理对EC9706细胞侵袭能力的影响

2.5 Real-timeqPCR验证关键差异性表达靶点

如图4所示，经双因素方差分析，ITGB6、Serpine1和miR-205的转录水平表达量在对照组和DMC-fla组的比较中存有显著性差异，均呈下调趋势，验证了RNA-seq和microRNA测序的结果，并说明这3个靶基因的表达受到了大米草黄酮的抑制，进而降低了EC9706细胞的侵袭力。

图3 RNA-seq和microRNA测序后显著性差异表达位点的筛选结果

图4 qPCR验证挑选的靶基因的差异性表达

大米草作为入侵物种，对福建省沿海生态和海水养殖造成了巨大破坏，然而本课题组研究发现大米草植物总黄酮的含量丰富，在完善其提取工艺后，大米草黄酮表现出良好的抗氧化性[11]和抑癌性[5]。植物黄酮类化合物是很多中草药抗癌的有效成分，多种黄酮类物质对肿瘤细胞侵袭力具有抑制作用，如芹黄素抑制人乳腺癌MCF-7细胞侵袭[12]，槲皮素降低人结肠癌SW480细胞的浸润迁移[13]，三叶青黄酮[8]与姜黄素[9]对食管癌EC9706细胞侵袭力具有抑制作用。本研究通过细胞划痕愈合和Transwell穿透实验也表明大米草黄酮对EC9706细胞侵袭力的抑制作用。

近年来，对食管癌转移的分子病理学研究逐渐受到重视，RNA-seq和microRNA测序技术已被采用于食管癌与癌旁组织的表达谱比对中，并提供了大量与食管癌侵袭浸润相关的、具有临床学意义的指标性靶位点，其中ITGB6[14]、Serpine1[15]和miR-205[16]等的高表达与食管癌细胞的侵袭力呈正相关。本研究中发现，食管癌EC9706细胞经大米草黄酮处理后，细胞内ITGB6、Serpine1和miR-205的表达呈明显下调趋势，与其侵袭力下降相关联。目前已被证实的黄酮抑癌侵袭力作用机制为三叶青黄酮下调Notch1[8]和姜黄素下调Est-1、MMP9[9]的表达，而下调ITGB6、Serpine1和miR-205是否为大米草黄酮抑癌侵袭力的作用机制，仍有待进一步研究验证。

3 结论

转录组和miRNAs数据显示在大米草黄酮作用下，EC9706细胞ITGB6、Serpine1和miR-205的转录水平表达量被显著地下调降低，暗示着这3个靶点是大米草黄酮抑制食管癌细胞侵袭力的潜在作用靶点。但目前还未将转录组数据与miRNAs表达谱进行联合分析，未来将进一步进行数据挖掘分析，力图找到miRNA作用关键靶基因mRNA从而调控细胞迁移的作用通路，明确大米草黄酮抑癌细胞迁移的分子机制，为大米草的药用价值开发和变害为宝的防治策略提供理论依据。