黄治伟，谭鹏,2，杜毅超,2，石昊，陈浩，钱保林，刘羽，付文广,2，李秋

[西南医科大学附属医院 1.普通外科（肝胆） 2.四川省院士（专家）工作站，四川 泸州 646000；3.西昌市人民医院 普通外科，四川 凉山 615000]

胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，其发病率在消化道肿瘤里排名第6位。由于胰腺特殊的解剖学位置，及肿瘤早期症状不典型，患者就诊时多已是晚期，因此临床治疗预后极差[1]。目前临床治疗胰腺癌的方式首选手术，但确诊后仅有20%的患者适合手术，且术后复发率高达80%，对于局部晚期不能切除或者转移性胰腺癌的患者，可采用吉西他滨、舒尼替尼等进行化疗或靶向药物治疗，有研究[2]表明，化疗及靶向药物联合使用比单独用药具有更好的疗效。尽管近年来胰腺癌的诊治获得了一定的发展，但患者的5年总体生存率仍低于10%，究其原因还是癌细胞的高生长性与转移性[3-4]。因此，研发新药物用以抑制癌细胞的增殖与转移是治疗胰腺癌的基础。

中医药用于肿瘤的治疗在我国由来已久，其作用靶点多、疗效显著等优势使得越来越多的中草药研发得以开展[5]。隐丹参酮（cryptotanshinone，CPT）是一种从植物丹参中提取的天然产物，除具有抗炎、抗纤维化的作用外还能抑制肿瘤细胞的生长，如宫颈癌细胞、前列腺癌细胞等[6-9]。但其对胰腺癌细胞抑制作用的机制鲜有报道。本实验旨在研究隐丹参酮对人胰腺癌细胞BxPC-3及SW1990生长和迁移的影响，以及其潜在的分子机制，为其作为胰腺癌的临床治疗手段提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胰腺癌细胞株BxPC-3和SW1990，购自中国科学院细胞库。隐丹参酮（分子式：C₁₉H₂₀O₃），纯度≥98%，规格20 mg/瓶，货号SC8640，购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA强裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、CCK-8试剂、结晶紫染色液均购自上海碧云天生物技术有限公司；CDK4抗体、GAPDH抗体、山羊抗鼠IgG二抗、山羊抗兔IgG二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司；vimentin抗体购自武汉塞维尔生物科技有限公司；Akt抗体购自成都正能生物技术有限责任公司；p-Akt抗体购自上海碧云天生物技术有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养、分组及处理采用含10% 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM 培养基培养人胰腺癌细胞株BxPC-3 和SW1990，于37 ℃、5% CO2培养箱中进行常规培养传代，取对数期细胞进行实验。BxPC-3 和SW1990 细胞分别分为4 组：对照组（DMSO）以及低、中、高3个浓度（10、20、40 μmol/L）CPT 处理组。

1.2.2 细胞的活力检测取对数生长期细胞，调整细胞浓度，将实验组与对照组BxPC-3 和SW1990 细胞以2×103/ 孔接种于96 孔板中培养，每组设置5 个重复，分别在0、1、2、3 d 时，加入CCK-8 试剂，继续培养1 h 后，用全光谱分光光度计测量光密度（OD450nm）。

1.2.3 克隆形成实验观察细胞克隆形成的能力将实验组及对照组的BxPC-3 和SW1990 细胞以2×103/孔均匀接种于6 孔板中，每组设置3 个重复，培养24 h 后将液体换为正常培养基，连续培养10 d，甲醇固定30 min 后PBS 洗净，用结晶紫染色液染色25 min，PBS 洗净，拍照并对镜下细胞数多于50 个细胞的克隆细胞团计数，计算相对克隆形成率= 实验组克隆数/ 对照组克隆数×100%。

1.2.4 细胞划痕实验观察细胞迁移能力的改变将对数生长期的BxPC-3 和SW1990 细胞均匀接种于6 孔板中，每组设置3 个重复，当细胞密度达到6 孔板80%～90% 时，用无菌枪头在培养皿中央划出直线，换液时，实验组给予CPT（10、20、40 μmol/L）处理24 h，对照组给予等量DMSO 处理, 分别在0 h 和24 h 时置于显微镜下观察并拍照。计算划痕愈合程度=（24 h 划痕距离-0 h 划痕距 离）/0 h 划痕距离×100%。

1.2.5 Transwell 实验检测细胞侵袭能力DMEM培养基与Matrigel 基质胶与冰上等比混匀，每个Transwell 小室加入100 μL 震荡混匀，将小室连同24 孔板置于37 ℃培养箱中凝固，实验组和对照组细胞以2×105/孔铺于小室中，每组设置3 个重复，继续培养24 h 后将滤膜固定在4% 多聚甲醛中并用结晶紫染色，拍照后对细胞进行计数。

1.2.6 Western blot 检测采用浓度为20 μmol/L的CPT 处理BxPC-3 和SW1990 细胞，将等量的DMSO 处理作为对照，分别在1、2、3 d 时收集细胞，加入裂解液充分裂解，提取上清液，BCA 法测定蛋白浓度，加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，煮沸制备成样品，经SDS-PAGE 凝胶电泳，冰浴恒流转膜后5%BSA 室温封闭。加入1:1000 稀释的Akt、p-Akt、vimentin、E-cadherin、CDK4、cyclin D1、GAPDH 一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育后显影，并对灰度值进行分析。

1.3 统计学处理

计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，经正态性检验和方差齐性检验后，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05则认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 CPT 对BxPC-3 和SW1990 细胞活力的影响

不同浓度CPT作用于人胰腺癌细胞株BxPC-3和SW1990不同时间后，CCK-8法检测细胞活力。与对照组比较，低、中、高3个浓度CPT处理组细胞活力明显降低，且作用时间越长，细胞活力越低（均P＜0.05）（图1）。提示CPT能明显抑制胰腺癌细胞的生长，且呈浓度和时间依耐性。

2.2 CPT 对BxPC-3 和SW1990 细胞克隆形成能力的影响

不同浓度CPT处理BxPC-3 和SW1990细胞 24 h后更换为正常培养基，继续培养10 d，观察细胞克隆形成情况并计算相对克隆形成率，结果显示，CPT处理后细胞克隆形成数量明显减少，并且CPT浓度越大，抑制作用越强（P＜0.05或P＜0.01）（图2）。

图1 不同浓度CPT 处理不同时间对BxPC-3 和SW1990 细胞活力的影响Figure 1 Effects of treatment of different concentrations of CPT for different times on the viability of BxPC-3 and SW1990 cells

图2 不同浓度的CPT 对人胰腺癌细胞株BxPC-3 和SW1990 细胞克隆形成能力的影响Figure 2 Effects of different concentrations of CPT on the colony forming ability of human pancreatic cancer BxPC-3 and SW1990 cells

2.3 CPT 对BxPC-3 和SW1990 细胞迁移能力的影响

不同浓度药物作用24 h 后，BxPC-3 细胞划痕愈合程度分别为（58.20±2.67）%、（23.45±10.00）%、（17.05±3.79）%，对照组为（84.93±9.19）%，SW1990细胞对照组与药物处理组划痕愈合程度分别（53.72±3.40）%、3（39.37±6.78）%、（9.42±2.01）%、（6.36±0.20）%，两种细胞对照组与实验组之间差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）（图3）。

图3 不同浓度的CPT 处理24 h 对BxPC-3 和SW1990 细胞迁移能力的影响Figure 3 Effect of treatment of different concentrations of CPT for 24 h on migration abilities of BxPC-3 and SW1990 cells

2.4 CPT 对BxPC-3 和SW1990 细胞侵袭能力的影响

不同浓度CPT处理BxPC-3和SW1990细胞24 h后，与对照组比较，穿过基质胶的细胞数量明显减少，表明CPT能够有效降低胰腺癌细胞的侵袭力，并且这一作用具有浓度依赖性（均P＜0.01）（图4）。

图4 不同浓度的CPT 处理24 h 对BxPC-3 和SW1990 细胞侵袭能力的影响Figure 4 Effect treatment of different concentrations of CPT for 24 h on the invasion ability of BxPC-3 and SW1990 cells

2.5 CPT 对BxPC-3 和SW1990 细 胞Akt 相 关蛋白表达的影响

CPT 20 μmol/L处理细胞1、2、3 d后，Akt、p-Akt、蛋白随着时间的延长，表达量逐渐下降，EMT相关蛋白vimentin、E-cadherin以及细胞周期相关蛋白CDK4、cyclin D1的表达也在逐渐下降（P＜0.05或P＜0.01）（图5），表明CPT可能通过影响Akt的表达，并进一步下调vimentin、E-cadherin、CDK4、cyclin D1的表达。

图5 CPT 对BxPC-3 和SW1990 细胞Akt、EMT 相关蛋白、细胞周期相关蛋白表达的影响Figure 5 Effect of CPT on expressions of Akt, EMT-associated proteins and cell cycle-related proteins

3 讨 论

胰腺癌早期诊断的不明确性以及癌细胞的高生长与转移能力导致患者死亡率增加，仅15%～20%的患者在诊断时为早期，具有手术指征，并且术前采用新辅助治疗可在一定程度上延长患者术后的生存时间[10-11]。对于失去手术指征，或不能耐受手术的患者，目前常用5-氟尿嘧啶和吉西他滨单独或联合化疗，化疗药物能促进肿瘤细胞的凋亡，但同时对正常组织细胞也具有抑制作用，因此治疗效果仍不理想[12-13]。而对于局部晚期不能切除或者转移性胰腺癌的患者，可采用厄洛替尼、舒尼替尼、依维莫司等进行靶向治疗，但其治疗费用太过昂贵，且大多药物在我国内地还未上市。因此，新治疗药物的研发，用以抑制胰腺癌细胞的生长与转移，是一个亟待解决的问题。

CPT是一种从药用植物丹参中提取的天然产物，除对心血管系统、神经系统等良性疾病具有良好的治疗效果外[14-16]，还被证实具有多种抗癌作用。叶欢等[17]总结国内外研究发现，CPT可抑制肿瘤细胞的多种生物学行为，对肿瘤的生长、侵袭等诸多过程产生影响。其菲醌结构中的菲环能够抑制肿瘤细胞DNA的合成，并通过抑制STAT3磷酸化及降低核转位过程，下调细胞周期蛋白表达，引起细胞周期阻滞在G1/G0阶段，从而抑制肿瘤细胞的增殖；并且CPT可有效阻碍HIF-1α与VEGF启动子结合，发挥抗肿瘤血管生成的作用；此外，CPT通过影响凋亡相关基因p53、Bcl-2等的表达，启动肿瘤细胞凋亡过程；而在肿瘤细胞侵袭过程中，CPT可通过抑制ICAM-1、VCAM-1以及MMP-9的表达，降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力[18-21]。

Akt作为关键蛋白，在胃癌、食管癌、胰腺癌以及肝癌等众多肿瘤的生长、侵袭、迁移中发挥着重要作用，Akt的高表达加快了许多肿瘤的恶性进程，如增殖加快，侵袭、迁移能力增强以及EMT的发生等[22-27]。近来研究表明，Akt蛋白是CPT发挥抗癌作用的重要靶点，Kim等[28]发现CPT可下调Akt/GSK3β通路蛋白表达，从而抑制非小细胞肺癌增殖，诱导细胞凋亡；Zhang等[29]通过体内外实验探究发现，CPT可通过抑制Akt/mTOR通路，降低结肠癌的侵袭和迁移能力。已有研究[30]发现，CPT可通过降低STAT3的表达，抑制胰腺癌细胞增殖，并诱导凋亡，但其对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响暂未报道，并且CPT是否能抑制胰腺癌的EMT进程仍未可知，而Akt作为加速肿瘤恶性生物学行为的重要蛋白，CPT能否通过下调Akt的表达而发挥抗胰腺癌的作用仍需探究。

本实验采用不同浓度的CPT处理胰腺癌BxPC-3和SW1990细胞，结果显示，CPT能够明显抑制胰腺癌细胞的生长及迁移能力，并且具有浓度依赖性。CDK4作为调控细胞周期的关键蛋白，随着20 μmol/L CPT处理胰腺癌细胞时间的延长，表达逐渐下降，其下游cyclin D1表达也随着CDK4的下调而减少，这表明CPT可能导致了BxPC-3和SW1990细胞生长周期阻滞，从而抑制了生长。EMT标志蛋白vimentin以及E-cadherin蛋白的表达也随着CPT作用时间的延长而下调，表明CPT能够抑制胰腺癌的EMT过程，降低胰腺癌的恶性程度。此外，本研究进一步检测了PI3K/Akt通路中的关键蛋白Akt及其磷酸化后p-Akt的表达情况，结果发现，CPT可明显下调Akt 蛋白总量，提示CPT下调磷酸化Akt的表达可能是通过下调总Akt蛋白表达引起的，并不是通过抑制Akt的磷酸化过程引起的。而总Akt蛋白表达的减少，则可能是由上游PI3K的表达变化所引起的，但本研究中未检测Akt上游PI3K的变化，在后续的研究中将考虑进一步完善。

综上所述，本研究通过体外实验发现，Akt可能是CPT抑制胰腺癌细胞生物学特性的机制中的一个重要节点。CPT能够同时下调Akt及p-Akt的表达，并进一步影响CDK4、cyclin D1、vimentin以及E-cadherin的表达，从而抑制BxPC-3和SW1990细胞的生长和迁移能力，同时影响其EMT 的进程。但其确切机制还有待深入研究，接下来还需在胰腺癌异种移植瘤模型上进一步验证CPT对胰腺癌的抑制作用，并且该药对临床患者的安全性及疗效还有待评估。本研究为进一步将CPT作为治疗胰腺癌的潜在药物提供了重要的理论依据。