张翔 颜卫文 王雅纯

1. 海南医学院第一附属医院神经内科，海南 海口 570100 2.海南医学院第一附属医院核医学科，海南 海口 570100 3.海南医学院第一附属医院全科医学科/老年科，海南 海口 570100

骨质疏松症(OP)是一种全身性疾病，其特征在于骨基质和矿物质的减少，导致骨小梁的破坏和破裂以及骨的脆性增加，从而降低生物力学性质[1]。随着年龄的增加，人体对钙的吸收随着成骨细胞产生的减少而减少，导致骨质流失逐渐增加，最终导致OP的发生[2]。预防和治疗OP包括摄取足够的维生素D和钙，适当的运动和其他生活方式干预措施[3]。红景天甙是红景天根的活性成分，具有多种药理作用，包括抗炎、抗癌、抗氧化等[4-5]。近年来的研究表明，红景天甙对雌激素缺乏引起的大鼠骨质疏松症有保护作用[6]。然而，没有关于红景天甙与碳酸钙结合预防和治疗OP的报道。因此，本研究旨在通过在老年雌性大鼠中采用红景天甙与碳酸钙结合，观察其对骨密度、骨矿物质和氧化应激的影响，为临床预防和治疗OP提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选择10只年龄为3个月，体重180～250 g的雌性无特定病原体(SPF)Sprague-Dawley(SD)大鼠作为对照组。选取40只年龄为24个月的雌性SPF SD大鼠作为实验组。50只实验动物购自上海实验动物中心(编号SCXK 2012-000)。将大鼠饲养在塑料笼中，控制温度和光照周期(24 ℃和12/12光周期)，湿度为40%并自由饮食。该研究经我院伦理委员会批准。

1.2 实验试剂和实验仪器

碳酸钙、红景天甙(Sigma-Aldrich，San Francisco，CA，USA)；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(南京建成生物工程研究所，南京)。双能X射线吸收测定仪(Hologic，Marlborough，MA，USA)；全自动生化分析仪(深圳市迈瑞生物医药电子有限公司)；连续波长多功能酶标仪(Tecan，Salzburg，Austria)。

1.3 实验方案

40只老年雌性SPF大鼠适应性喂养一周，然后随机分成4组，每组10只动物，即模型组(OP组)，红景天甙组(H组)，碳酸钙组(Ca组)和红景天甙联合碳酸钙组(H+Ca组)，10只3月龄大鼠作为对照组(NC组)。所有大鼠在SPF系统中饲养，饲喂普通饲料，并在实验过程中自由饮食。H组大鼠每天一次用20 mg/kg红景天甙灌胃给药; Ca组大鼠每天一次灌胃给予20 mg/kg碳酸钙；H+Ca组大鼠每天一次用20 mg/kg红景天甙和20 mg/kg碳酸钙灌胃给药；NC和OP组大鼠每天灌胃生理盐水连续12周。

1.4 测量骨密度

在最后一次胃内给药结束后，给大鼠禁食8 h。大鼠称重后，腹膜内注射50 mg/kg 2%戊巴比妥钠用于麻醉。将大鼠的四肢固定，通过双能X射线吸收测定法测量腰椎(L4-L6)和双侧股骨的骨密度。

1.5 检测血清指标

测量骨密度后，从腹主动脉抽取血液，并在4 ℃以1 200 r/min离心10 min。分离血清并在-80 ℃冰箱中冷冻保存。血清样品使用ELISA试剂盒(Blue Gene，China)测量血清I型胶原C端肽(CTX-1)、骨钙素、碱性磷酸酶(ALP)、I型前胶原N端肽(PINP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)。按照检测试剂和说明检测血清SOD、MDA和GSH-Px。通过连续波长多功能酶分析仪在550 nm处测量各组SOD的含量；在532 nm处测定各组的MDA含量，在412 nm处检测各组GSH-Px含量。

1.6 骨矿物质含量的测定

分离大鼠的左股骨，并除去附着的软组织。将股骨在110 ℃的烘箱中烤至48 h至恒重。通过分析天平称量骨骨干重，并计算骨干重与体重的比率。然后，将股骨在室内型电阻炉中700 ℃下焚烧6 h。通过分析天平对灰分重量进行加权，并计算骨灰重量与体重和骨灰重量与骨干重(%)的比率。

1.7 统计学处理

实验结果使用均数±标准差表示；通过SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。独立样本t检验用于两组之间的比较，并且单因素方差分析(ANOVA)用于多组之间的比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠骨密度的变化

与NC组相比，OP、H、Ca组大鼠腰椎和双侧股骨骨密度明显降低(P<0.05或P<0.01)；与OP组相比，H、Ca、H+Ca组大鼠腰椎和双侧股骨骨密度明显增加(P<0.05)；与H、Ca组比较，H+Ca组大鼠腰椎和双侧股骨骨密度明显升高(P<0.05)；H+Ca组和NC组骨密度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，红景天甙和碳酸钙均可显著改善老年大鼠的骨密度，并且联合使用显示出更显著的效果，见表1。

表1 各组大鼠腰椎和双侧股骨的骨密度比较

2.2 每组大鼠的骨矿物质代谢比较

与NC组比较，OP组骨干重、骨干重与体重比、骨灰重、骨灰重与体重比显著降低(P<0.05或P<0.01)；与OP组相比，H、Ca、H+Ca组大鼠的这些指标均明显升高(P<0.05或P<0.01)；与H组和Ca组相比，H+Ca组大鼠的这些指标均显著升高(P<0.05)；H+Ca和NC组间这些指标的比较差异无统计学意义(P> 0.05)。结果显示，红景天甙和碳酸钙均可显著降低骨质疏松症大鼠的骨矿物质损失，并且该组合显示出更显著的效果，见表2和3。

表2 各组大鼠骨干重的比较

2.3 各组大鼠血清骨代谢指标比较

与NC组相比，OP组大鼠血清ALP、CTX-1、骨钙素、TRACP-5b和PINP水平显著升高(P<0.05或P<0.01)；与OP组相比，H、Ca、H+Ca组大鼠ALP、CTX-1、骨钙素、TRACP-5b和PINP水平明显降低(P<0.05)；与H组和Ca组相比，H+Ca组大鼠血清ALP、CTX-1、骨钙素、TRACP-5b和PINP水平显著降低(P<0.05)；H+Ca和NC组之间的这一水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示，红景天甙和碳酸钙可明显降低骨质疏松症大鼠的血清ALP、CTX-1、骨钙素、TRACP-5b和PINP水平，并且联合治疗显示出更显著的效果，见表4。

表4 各组大鼠骨代谢水平比较Table 4 Comparisons of calcium and phosphorus levels in rats among

2.4 各组大鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量的变化

与NC组相比，OP、H、Ca组大鼠血清SOD和GSH-Px活性显着降低(P<0.05或P <0.01)，MDA含量明显升高(P<0.05或P<0.01)。与OP组相比，H、Ca、H+Ca组大鼠血清SOD和GSH-Px活性明显升高(P<0.05或P<0.01)，MDA含量明显降低(P<0.05或P<0.01)；与H、Ca组比较，H+Ca组大鼠血清SOD和GSH-Px活性均显著升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)；H+Ca和NC组之间的这些水平的比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果显示，红景天甙和碳酸钙均可显著提高血清SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，并且联合治疗显示出更显著的效果，见图1。

图1 组间超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的比较注：与NC组相比，*P<0.05，**P<0.01；与OP组相比，#P<0.05，##P<0.01；与H组比较，△P<0.05；与Ca组比较，▲P <0.05。Fig.1 Comparison of superoxide dismutase (SOD), activity malondialdehyde (MDA) content and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity among groups

3 讨论

近年来，随着中国进入老龄化时期，骨质疏松症的发病率逐年上升，其骨折等并发症严重影响人们的生活。对骨质疏松症的研究引起了中国和其他学者的广泛关注。钙是人体矿物质中重要的微量元素之一，骨质疏松症的主要病理变化是骨矿物质流失。其中，缺钙是骨质疏松症的重要原因，因此，补钙是预防和治疗骨质疏松症的最有效和最安全的方法[7]。适当补充钙可以增强骨钙水平并增加骨密度，从而显著改善骨形成[8]。红景天甙是从玫瑰红景天根中提取的主要生物活性化合物，研究表明，红景天甙可改善雌激素缺乏引起的骨质疏松[9]和链脲佐菌素引起的糖尿病[10]的症状。但是，尚无证据表明红景天甙联合碳酸钙治疗对老年大鼠骨量的影响。

本研究在老年大鼠模型中观察到BMD和骨量降低，骨代谢水平增加和氧化应激增加。红景天甙治疗12周后，BMD和血清骨转换指标均显著改善，表明红景天甙联合碳酸钙能够缓解年龄引起的骨量流失。骨转换生物标志物反映了骨的形成和吸收，因此可以反映骨重塑的状态，这是骨质疏松症的潜在机制[11]。BTM包括骨形成和再吸收标志物。骨形成生物标志物是由成骨细胞合成的，因此反映了特定的成骨细胞功能，其中包括ALP、骨钙蛋白和PINP[12]。已经提出增加骨形成标记物作为绝经后妇女骨质疏松症的可能预测指标[13-14]。在本研究中，老年大鼠血清中骨形成增加可能是由于活跃的成骨细胞试图补偿由于雌激素缺少引起的骨质流失。骨吸收标记包括CTX-1和TRACP-5b。据报道，女性中CTX-1和TRACP -5b水平升高与BMD呈负相关[15]。在这项研究中，老年大鼠的骨形成(ALP、骨钙蛋白、PIPN)和骨吸收(CTX-1和TRACP-5b)标志物均增加，表明骨转换率增加；而红景天甙的补充可显著提高老年大鼠骨密度、降低骨代谢水平、减少骨矿物质流失，与碳酸钙有协同作用，联合用药效果显著。

由活性氧引起的有害作用在骨质疏松症发生发展中起重要作用[16]。生物体中过多的骨吸收会增加活性氧的产生，导致破骨细胞和成骨细胞的破坏，导致骨量减少。随着年龄的增长，体内自由基的含量逐渐增加，而吸烟、饮酒等不健康的生活方式可以诱导氧化应激，提高自由基水平，从而增加骨吸收[17]。本研究表明，红景天甙和碳酸钙可以增加老年大鼠的SOD和GSH-Px活性，减少MDA的产生，从而发挥抗氧化应激的作用；它们具有协同效应，并且显示出更显著的效果。

总之，该研究显示老年大鼠的骨密度、骨矿物质损失、骨代谢水平明显升高和氧化应激显著下降，但红景天甙和碳酸钙的补充可显著提高抗氧化应激能力，增加骨密度，降低血清骨代谢水平；并减少骨矿物质流失，从而预防和治疗骨质疏松症。这两种物质具有协同作用，并且该联合使用显示出更显著的效果，这为临床预防和治疗骨质疏松症提供了实验基础。当然也需要进一步研究相关的分子生物学机制。