刘伟 赵宝辉 刘晓峰

河北大学附属医院骨三科，河北 保定 071000

骨质疏松症(OP)是一种全身性疾病，其特征在于骨基质和矿物质的减少，导致骨小梁的破坏和破裂以及骨的脆性增加，从而降低生物力学性质[1]。OP主要影响绝经后的妇女和老年人，导致髋和脊柱骨折[2-5]。在过去的几十年中，已经使用了双膦酸盐，地诺单抗和PTH类似物进行干预，它们是骨吸收的抑制剂或骨形成的刺激物[2-5]。 研究表明使用抗氧化剂可以清除自由基、改善睡眠、抗肿瘤、调节机体免疫反应和其他生物功能[6]；进一步研究这类药物还可以介导体内甲状腺素和降钙素的分泌，从而调节体内钙代谢[7]。近年来，抗氧化剂已被一些学者用于预防和治疗OP[8]。然而，没有关于硫辛酸与碳酸钙结合预防和治疗老年OP的报道。因此，本研究旨在通过在老年雌性大鼠中采用硫辛酸干预，观察其对骨密度、骨量和氧化应激的影响，为临床预防和治疗老年骨质疏松提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

20只24月龄和10只3月龄雌性SPF级SD大鼠购自Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.，Ltd(许可证编号SCXK 2012-0002；中国上海)。将大鼠饲养在笼中，控制温度和光照周期(24 ℃和12/12光周期)，湿度为40 %并自由饮食。该研究经河北大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 实验试剂和实验仪器

硫辛酸(Sigma-Aldrich，San Francisco，CA，USA)。双能X射线吸收测定仪(Hologic，Marlborough，MA，USA)；全自动生化分析仪(深圳市迈瑞生物医药电子有限公司)；连续波长多功能酶标仪(Tecan，Salzburg，Austria)。

1.3 实验方案

20只老年雌性大鼠随机分成2组，每组10只动物，老年组(Old组)和硫辛酸治疗组(ALA组)；10只3月龄大鼠作为青年组(Con组)。所有大鼠在SPF系统中饲养，饲喂普通饲料，并在实验过程中自由饮食。ALA组大鼠每天一次用60 mg/kg硫辛酸腹腔注射给药； Con组和Old组大鼠每天腹腔注射生理盐水连续治疗12周。

1.4 影像学和组织学检测

使用微型计算机断层扫描(Micro-CT)(Skyscan 1176，Aartselaar，Belgium)对右股骨干骺端骨小梁结构进行了评估。分析了包括骨体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和结构模型指数(SMI)在内的骨小梁参数。骨密度(BMD)使用Micro-CT检测。使用Skyscan Nrecon软件重建扫描图像，并使用CTan软件(Kontich，比利时)进行分析。使用CT Vox软件(3.0版，Skyscan)获得右股骨远端区域的3D模型。随后按照标准组织切片操作步骤，股骨干骺端使用EDTA(0.5 mol/L，pH=8.0)脱钙后并包埋在石蜡中。使用切片机器切成5 μm厚切片，并用苏木精和曙红(HE)染色在显微镜下观察。

1.5 检测血清指标

测量骨密度后，从腹主动脉抽取血液，并在4 ℃以2 000 r/min离心10 min。分离血清并在-80 ℃下冷冻保存。采用全自动生化分析仪检测血清钙和磷。使用ELISA试剂盒(江林生物技术有限公司，中国 上海)测量血清抗酒石酸盐酸性磷酸酶异构体5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRACP-5b)。使用ELISA试剂盒(Zeye Biotechnology，中国 上海)测量血清I型胶原羧基端肽β特殊序列(β isomer of C-terminal telopeptide of type I collagen，β-CTX)、骨组织骨保护素(osteoprotegerin, OPG)和骨特异性碱性磷酸酶(bone alkalin phosphatase, BALP)水平。

1.6 蛋白印记(WB)检测

在添加了蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中溶解骨髓组织，并进行低频超声处理。通过离心获得含有总蛋白的上清液，其浓度通过二辛可宁酸蛋白测定法(Beyotime，中国 上海)测量。 根据目标蛋白的分子量，将等量的总蛋白上样至10%或15%SDS PAGE。将蛋白质转移到PVDF膜(Millipore)上，并在5%脱脂牛奶中于室温下封闭2 h，然后在4℃下与NF-κB一级抗体(1∶2 000，Abcam)，Caspase-3(1∶2 000，CST)，PARP(1∶2 000，CST)，GAPDH(1∶10 000，Abcam)一起孵育过夜。用TBST洗涤3次后，将膜与第二抗体HRP山羊抗小鼠(ASPEN)在室温下孵育1 h。 用Chemi Lumi One Ultra(Tanon，中国)检测蛋白条带的灰度。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠骨量和骨密度改变

所有组的大鼠股骨干骺端进行HE染色，以进一步观察组织学变化，如图1 A所示。在Old组中，组织学检查显示出大量的骨小梁已经消失和少量不规则排列的骨小梁。而使用ALA治疗后，骨小梁的数量和之间的连接在一定程度上得到了改善。

Micro-CT三维重建结果和骨小梁定量结果如图1 B所示；与Con组大鼠相比，Old组大鼠SMI的显著升高，而Tb.Th、Tb.N和BV/TV的水平显著降低(P均<0.05)。在ALA治疗后，老年大鼠的骨小梁参数和骨密度表现出显著改善。其中BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th值显著升高；而SMI显著降低。

图1 各组大鼠股骨干骺端骨小梁形态学检测结果注：与 Con组比较，*P<0.05、**P<0.01；与 Old组比较，#P<0.05。Fig.1 Morphological test results of femoral metaphyseal trabeculae in each group of rats

2.2 各组大鼠血清骨代谢指标的变化

各组之间的血清骨代谢水平如图2中。三组大鼠治疗12周后血清中Ca和P未见明显改变(P>0.05)。与Con组大鼠相比，Old组大鼠血清中BLAP和OPG水平显著降低；而TRACP-5b和β-CTX显著升高(P<0.01)。然而，使用ALA治疗显著增加BLAP和OPG水平；而TRACP-5b和β-CTX显著降低(P<0.01)。

图2 各组大鼠血清骨代谢指标水平注：与 Con组比较，*P<0.05、**P<0.01；与 Old组比较，#P<0.05。Fig.2 Serum bone metabolism index levels in each group of rats

2.3 治疗对NF-κB、Caspase-3和PARP表达的影响

ALA治疗对NF-κB、Caspase-3和PARP表达的影响如图3所示；图3显示了Old组大鼠的NF-κB、Caspase-3和PARP水平较Con组显著增加(P<0.01)。与Old组相比，ALA治疗后的股骨组织中NF-κB、Caspase-3和PARP表达被抑制(P<0.01)。

图3 NF-κB、Caspase-3和PARP蛋白表达情况注：与 Con组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与 Old组比较，#P<0.05，##P<0.01。Fig.3 Expression of NF-κB, Caspase-3 and PARP proteins

3 讨论

OP的主要特征是骨组织微观结构的退行性变化，骨量减少和骨脆性增加，从而显著增加骨折风险。OP在老年人中很普遍，年龄是OP的主要危险因素。近年来，随着中国进入老龄化时期，OP的发病率逐年上升，其骨折等并发症严重影响人们的生活。对OP的研究引起了中国和其他学者的广泛关注。

硫辛酸是线粒体多酶复合物中天然存在的必需辅酶，其催化α-酮酸的氧化脱羧，例如丙酮酸、α-酮戊二酸和支链α-酮酸[9]；其已被证明是一种潜在的抗氧化剂。一些研究提供证据表明补充α-硫辛酸可以减少氧化应激并恢复体内其他抗氧化剂水平，也有证据表明其可能在体外发挥促氧化特性[9]，因为衰老导致线粒体膜结构恶化[9]。抗氧化剂具有广泛的生物学功能，其机制不同；在骨代谢方面，抗氧化剂可以抑制破骨细胞的增殖和分化，促进成骨细胞的增殖和分化，并通过多种信号通路促进骨基质的矿化[10]。细胞实验表明，抗氧化剂可以刺激骨细胞和成骨细胞的增殖[11]。此外，它可以上调runt2相关转录因子(RUNX2)的表达，抑制过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)的表达，从而促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞[11]。动物实验表明，抗氧化剂可显著增加雄性小鼠的骨密度和骨小梁体积，但明显减少破骨细胞的大小和数量[12]。本研究表明，硫辛酸的补充可显著提高老年大鼠骨密度，提高骨密度，改善骨代谢。

由活性氧引起的骨毒性在OP的发生中起重要作用[13]。生物体中过多的骨吸收会增加活性氧的产生，导致破骨细胞和成骨细胞的破坏，导致骨量减少。随着年龄的增长，体内自由基的含量逐渐增加，而吸烟、饮酒等不健康的生活方式可以诱导氧化应激，提高自由基水平，从而增加骨吸收[14]。动物实验表明，随着抗氧化剂水平的降低，体内抗氧化应激水平降低，而体内炎症水平增加。可以看出，维持正常的抗氧剂水平可以减少自由基的损害[15]。NF-κB是通过促进炎症因子分泌而诱导炎症的关键信号[16]。NF-κB的活化可促进破骨细胞的分化和成熟，从而导致骨破坏并破坏骨形成[17]。本研究的数据表明，ALA可以通过抑制NF-κB信号介导炎症反应而减少骨量的流失。

综上，本研究发现ALA通过抑制NF-κB信号传导保护老年大鼠骨量。但是，本研究存在一些局限性。具体而言，实验模型的数量相对较少，因此导致测量数据有限。此外，除了股骨外，我们还没有探讨关节、脊柱、手腕或其他骨骼的骨质疏松症。最后也是最重要的限制是我们只依靠Micro-CT来研究骨量，但是没有进行生物力学测试来测量骨强度。总之，在本研究中，我们指出了ALA可预防老年大鼠的骨量丢失。