关 睿， 李 琳， 王建辉， 蒙 荣， 黄轶群

(长沙理工大学 化学与食品工程学院， 湖南 长沙 410114)

食盐在水产食品储藏和加工中起着非常重要的作用。首先，食盐能够有效地抑制微生物的生长繁殖，具有保鲜和延长水产品货架期的作用[1-2]。食盐的添加不仅能够降低水产品的水分活度，提高渗透压，达到抑制腐败变质的作用，而且食盐溶液中的Na+和Cl-在高浓度时能对微生物产生毒害作用[3]。其次，在预制鱼肉中添加食盐，可以降低冰点和肌球蛋白的变性温度，减小蛋白质变性的可能性，有利于提高鱼肉在低温储藏过程中品质的稳定性[4]。再次，食盐因其可溶性和吸湿性的特点被应用于水产品解冻工艺中，盐水可以加速冰的融化，而且盐水具有抑菌作用，降低因解冻引起的相关安全风险[5]。最后，食盐的添加可以增加离子强度，影响蛋白质的表面电荷，促进盐溶性肌原纤维蛋白的溶解，在适当的盐浓度条件下，有利于形成蛋白质网络和蛋白质凝胶，提高鱼糜和重组鱼肉制品的质构等品质特性[4,6]。

鱼肉腌制过程中，食盐的添加对其品质的影响的研究报道较多，尤其是关于高盐浓度(3%～12%)对腌制鱼肉制品品质影响的文章较为常见[7-11]。例如，邢云霞等[10]研究了质量分数为3%～9%的食盐对干腌草鱼(10 ℃，1～6 h)的水分含量及水分活度、色泽、pH值、硫代巴比妥酸反应物、挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen, TVB-N)、盐溶性蛋白质、质构和感观评价指标的影响，并确定质量分数为5%的食盐添加量为最佳盐浓度；叶路漫等[11]探讨了腌制过程中(4 ℃，2 h)，食盐的添加量(4%～12%)对风干金鲳鱼制品的水分含量、色泽、pH、质构和感觉评价指标的影响, 得出质量分数为8%是最佳盐浓度。近年来，随着人们对低盐健康食品需求的日益增加，有关较低盐浓度(1.5%～2%)腌制对鱼肉制品品质的研究时有报道，涉及的产品包括质量分数为2%盐腌处理的草鱼鱼片(4 ℃，0～12 d)[12]、质量分数为1.5%盐腌处理鲤鱼鱼片(4 ℃，0～16 d，真空包装)[13]、质量分数为2%盐腌制鳙鱼鱼片(4 ℃，0～15 d)[14]等。尽管目前已有不少有关盐浓度对腌制或冷藏期间鱼肉品质变化的影响的研究报道，但是尚缺乏较低盐浓度变化(如5% 以下)与相关产品品质内在关系的定量方面的研究，且实验结果往往只是基于单种盐浓度或单批次的鱼肉样品，缺乏重复实验或统计分析，使得研究结果的应用性或普适性受到较大的限制。因此，有必要开展系统性的研究以探明不同食盐添加量与冷藏鱼肉品质变化关系的定量方面的研究。

本研究以草鱼背部白肌肉为实验材料，采用双因素方差分析等方法，研究不同食盐添加量(质量分数为0%、0.5%、2.5%、5.0%)和冷藏时间(0 ℃，1、6、13 d)对于鱼肉品质变化的影响，并运用动力学反应方程式对鱼肉在冷藏期间的TVB-N生成速率进行拟合，探明盐浓度对鱼肉品质变化速度的影响，对于指导预制鱼肉等水产制品的储藏和加工、确保产品的品质具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠、乙二胺四乙酸二钠、没食子酸丙酯、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、硼酸、浓盐酸、甲基红、溴甲酚绿、乙醇、氧化镁均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

WSC-S型测色色差计，上海仪电物理光学仪器有限公司；T10型手持式均质机，德国IKA公司；UV 2600型紫外-可见分光光度计，上海舜宇恒平有限公司；DHG型电热恒温鼓风干燥箱，杭州奥科环境试验设备有限公司；DELTA320型pH计，梅特勒-托利多(上海)有限公司；FW100型高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品准备

鱼被宰杀后，去除鱼鳞和内脏，置于带冰的保温箱中在30 min内运回实验室。用无菌水清洗后，以草鱼背鳍起点为中点，切取10 cm宽的鱼段[15]，去除鱼皮及皮下红肌肉部分，取鱼侧线上方的白肌肉，切成约1 cm×1 cm×0.5 cm的鱼块，以保证实验所用样品的均一性[16]。将每批次鱼块混匀后分成4份，每份约120 g。一份用作对照，其余部分分别与质量分数为0.5%、2.5%、5.0% NaCl充分混合后，密封在无菌的塑料袋中，埋于冰中，在0 ℃下保存1、6、13 d后，分别从不同食盐浓度处理(0%、0.5%、2.5%、5.0%)的鱼肉中取样约40 g，低速匀浆20 s，然后高速匀浆10 s。将所有样品放置在密封的塑料袋中，并保存在冰中待用，2 h内进行分析所有相关指标。对于样品每个指标的测试，都是采用3次平行实验，取其平均值；总的实验过程采用3批不同的鱼样，重复3次。

1.3.2鱼肉基本组分及冷藏过程中失水率的测定

鱼肉中蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；脂肪含量的测定采用索氏抽提法，参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》；水分含量的测定采用直接干燥法，参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》。鱼肉的失水率为鱼肉在冷藏过程中与最初重量相比，取其质量变化的百分比。

1.3.3鱼肉pH值及色泽的测定

单因素方差分析(ANOVA)用于评价某些因素是否影响表1中问题Q2和Q3的回答。P值小于或等于0.05,可认为是显著的影响。表3列出了P值,P值小于0.05,表示该因素对某一问题回答的影响的显著性。认为探究式实验与传统实验相比有助于理解环境工程基本概念(问题Q2(a))的学生数量,在学年间有明显的不同。进一步的分析表明,探究式实验开设的第一学年,学生的反应明显高于以后的学年。这是由于学生知道这种实验是第一次开设,因而更重视这次锻炼。

参照GB/T 5009.45—2003《水产品卫生标准的分析方法》中的酸度计法，测定鱼肉pH值。称取约2 g绞碎鱼肉样品(精确到0.001 g)，置于烧瓶中，加入9倍蒸馏水均质，用经过标准化的pH计测其值。

采用色差计，在样品表面随机选取10个点测量HunterL*(lightness，亮度)，a*(redness，红度)，b*(yellowness，黄度)的值，取测量点的平均值。

1.3.4鱼肉中丙二醛含量的测定

参考Siu等[17]的硫代巴比妥酸方法，利用丙二醛在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸发生显色反应的特性，测定鱼肉中的丙二醛含量，其含量以每千克样品中的毫克数表示(mg/kg)。

主要步骤为称取2.00 g肉样，加入10 mL体积分数为7.5%的三氯乙酸水溶液(含φ=0.1%的乙二胺四乙酸二钠和没食子酸丙酯)，均质1 min，过滤。取5 mL滤液，加入5 mL 0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸溶液，90 ℃下水浴30 min，冰水浴冷却后测其532 nm处的吸光度。

1.3.5鱼肉中挥发性盐基氮的测定

参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的半微量定氮法测定TVB-N。主要步骤为5 g样品与100 mL三氯乙酸溶液(φ=2%)一起均质，充分振摇1 min，静置15 min后过滤。接收瓶内加10 mL硼酸溶液, 5滴混合指示液[V(甲基红乙醇溶液)∶V(溴甲酚绿乙醇溶液)=1∶5]，8.0 mL滤液，4 mL氧化镁混悬液(10 g氧化镁：1 L水)进行蒸馏。蒸馏完毕后以盐酸溶液(0.020 0 mol/L)滴定至紫红色。同时做试剂空白对照实验。鱼肉中TVB-N值按式(1)计算。

(1)

式(1)中，X为TVB-N值，mg/100 g；V1为试液消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；V2为试剂空白消耗盐酸标准滴定溶液的体积，mL；C为盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；14为滴定1.0 mL盐酸(1.000 mol/L)标准滴定溶液相当的氮的质量，g/mol；m为试样质量，g；V为准确吸取的滤液体积，mL。

1.4 分析方法

采用双因素方差分析方法(SPSS 22.0)，分析NaCl浓度和冷藏时间是否对鱼肉的pH、色泽、丙二醛和TVB-N含量具有显著性影响(α=0.05)以及NaCl浓度和冷藏时间对这些质量参数值的影响是否有显著的交互作用(interactive effect)，如果两个因素之间的影响没有显著的交互作用，则进一步采用单因素方差分析，分别确定不同盐浓度(不区分储藏时间)以及不同冷藏时间(不区分盐浓度)是否对相关的质量参数值有显著影响(α=0.05)；另外，采用Excel 2019，根据以下动力学反应方程式对含不同盐浓度的鱼肉在冷藏期间TVB-N的生成速率进行拟合。

dA/dt=kAn。

(2)

式(2)中，k为反应速率常数，t为冷藏时间，d；A为冷藏t天后鱼肉的TVB-N值，mg/100 g，n为化学反应级数(n=0、0.5、1、2)。

2 结果与分析

2.1 鱼肉样品基本成分及冷藏过程中的失水率

为保证储藏过程中所采用的鱼肉样品的一致性，实验中所用的样品均为鱼中段背部的白肌部分，因此样品的脂肪含量很低，只有0.40%～0.50%(0.43%±0.06%)，鱼肉中的水分含量为79.10%～79.53% (79.30%±0.22%)，蛋白质含量为19.60%～20.23%(19.81%±0.31%)。3批鱼肉中的水分、蛋白质和脂肪的含量非常接近，水分和蛋白质的相对标准偏差分别只有0.28%和1.56%。

鱼肉在冷藏过程中，失水率随着储藏时间的延长或食盐浓度的增加而增加，但是总的来说，失水率非常低，除了储藏13 d后含2.5%～5.0%食盐浓度的样品失水率平均达5.2%～5.8%外，其余的都低于5.0%, 大多数在1%～3%范围内，与Cao等[18]的研究结果类似。鱼肉冷藏期间的失水是不可避免的，主要是因为冷藏使得蛋白质变性，从而引起肌原纤维蛋白的持水性下降[18]；而食盐具有渗透脱水作用，并对蛋白质产生盐变性作用，使得鱼肉中的肌原纤维蛋白失水[10]，因此鱼肉失水率随食盐浓度的增加呈上升趋势。

2.2 食盐添加量及冷藏时间对鱼肉色泽的影响

双因素方差分析结果表明，食盐浓度对鱼肉的L*值和b*值以及冷藏时间对鱼肉的b*值有显著影响(P<0.05)，但是对其他的L*、a*、b*值没有显著影响(P>0.05)，而且食盐浓度和冷藏时间对L*、a*、b*值的影响均没有显著的交互作用。进一步单因素方差分析结果表明，只是添加5.0%盐处理的鱼肉的L*值(63.1±1.4)和b*值(10.8±0.8)的平均值与其他盐处理的鱼肉有显著性差异，其他3组鱼肉之间的L*值和b*值没有显著差异，对照组和含质量分数为0.5%、2.5% NaCl的三组鱼肉之间的L*值的平均值分别为61.5±2.4、60.9±1.7和60.2±1.7，对应的b*值分别为13.0±1.4、12.8±1.1、12.6±1.3；鱼肉冷藏13 d后的b*值(13.1±1.4)显著高于冷藏1 d(12.0±1.4)和6 d(11.8±1.1)后的b*值，但是b*值在储藏期间的变化并不大。因此，总体来说，即使有显著性差异，食盐浓度和冷藏时间对鱼肉的L*、a*、b*值的影响很小，这主要是因为本实验只采用了鱼中段背部的白肌部分，其颜色单一，而且成分相对简单，脂肪含量很低，几乎不含色素。

2.3 食盐添加量及冷藏时间对鱼肉pH值的影响

3批不同鱼肉在冷藏期间pH值的变化见图1，随着冷藏时间的延长，添加不同食盐浓度鱼肉的pH值的变化趋势基本一致，除第1批次5.0%加食盐样品外，鱼肉在冷藏1 d到6 d之间其pH值略有下降，而冷藏13 d后鱼肉的pH值均高于冷藏6 d后的pH值。根据3批鱼肉的pH值的平均值可以看出[图1(d)]，对照组、0.5%和2.5%食盐处理鱼肉的pH值在冷藏期间呈先下降再上升的V型变化趋势，而5.0%食盐处理的鱼肉的pH平均值在冷藏1 d到6 d之间没有明显变化。水产品的pH值在冷藏期间的下降与鱼肉中的糖原分解生成乳酸以及ATP分解生成游离磷酸基、肌苷酸等酸性物质相关，而pH值的上升则是由于蛋白质等含氮化合物酶解产生碱性物质[15]。另外，从图1还可以看出，2.5%和5.0%食盐处理使得鱼肉的pH值低于空白对照，且食盐浓度越高，pH值的下降更明显。冷藏1 d后，鱼肉的pH值分别为6.76±0.03(0% NaCl)，6.76±0.02(0.5% NaCl)，6.65±0.05(2.5% NaCl)和6.58±0.03(5.0% NaCl)；冷藏13 d后，对应值分别为6.84±0.11，6.82±0.03，6.72±0.05和6.69±0.07。这主要是由于较高浓度的食盐对微生物生长具有抑制作用，从而减缓了碱性物质的生成[16]。

图1 食盐添加量和冷藏时间对不同批次草鱼白肌pH值的影响Fig.1 Effects of salt addition and cold storage time on pH value of white muscle from different batches of grass carp

双因素方差分析的结果显示，冷藏时间和食盐浓度都对鱼肉的pH值具有显著影响(P<0.001)，但是冷藏时间和盐浓度对鱼肉pH值的影响没有显著的交互作用(P=0.963)。进一步单因素方差分析结果见图2，冷藏13 d后鱼肉pH值的平均值(n=12, 6.77±0.09)显著高于冷藏1 d(6.69±0.08)和6 d后(6.66±0.07)的值，这意味着鱼肉冷藏13 d后，因蛋白质等分解产生的碱性物质含量显著升高，其食用品质极有可能明显下降；另外，添加2.5%和5.0% NaCl鱼肉的pH平均值(n=9)分别为6.67±0.05和6.61±0.07，显著低于空白对照(6.77±0.09)和含0.5% NaCl(6.77±0.05)的鱼肉的pH平均值，这意味着2.5%和5.0%的食盐处理可能对鱼肉冷藏期间微生物的生长具有明显的抑制作用，从而使得碱性物质的生成显著减低，但是0.5%的食盐处理因浓度太低没有类似的效果。

不同字母代表显著性差异(P<0.05)。图2 食盐添加量和冷藏时间对草鱼白肌pH值的影响Fig.2 Effects of salt addition and cold storage time on pH value of white muscle from grass carp

2.4 食盐添加量及冷藏时间对鱼肉白肌脂肪氧化的影响

图3 食盐添加量和冷藏时间对不同批次草鱼白肌丙二醛含量的影响Fig.3 Effects of salt addition and cold storage time on malondialdehyde content in white muscle from different batches of grass carp

丙二醛的含量是衡量脂肪氧化的重要指标之一，食品储藏过程中丙二醛含量的提高通常意味着其品质的降低[17]。图3为含不同食盐浓度的3批鱼肉在冷藏条件下丙二醛含量及其平均值的变化情况，在冷藏过程中，不同食盐浓度处理的鱼肉中丙二醛含量均随时间的延长有不同程度的增加，冷藏6 d和13 d后鱼肉中丙二醛质量分数的平均值分别为冷藏1 d后的1.5～3.6倍和2.9～5.5倍，这说明尽管所用的鱼肉样品的脂肪含量很低，只有0.40%～0.50%，但冷藏过程中鱼肉的脂肪氧化仍非常明显，且脂肪氧化程度随着冷藏时间的延长而增加。

从图3还可看出，低浓度食盐(0.5%)的作用效果与较高浓度食盐(2.5%、5.0%)的效果相反。与未添加食盐的对照组相比，含2.5%和5.0% NaCl的鱼肉经不同的冷藏时间后，其丙二醛的平均值分别高于相应对照组28%～189% 和120%～322%，意味着较高浓度的NaCl(2.5%、5.0%)具有促进脂肪氧化的作用。肉类食品中NaCl的促氧化作用主要由于NaCl可以破坏肌红蛋白中铁离子与其结合蛋白之间的连接而使铁离子游离出来，游离铁离子对脂肪氧化有较强的促进作用[19]。但是，添加了0.5%食盐的鱼肉中的丙二醛含量总体来说低于相应的未添加食盐的对照组，其中冷藏6 d和13 d后的0.5%食盐处理鱼肉中的丙二醛的平均值分别比对照组低18%和31%，这表明低浓度食盐对脂肪氧化有一定的抑制作用。就我们所知，目前尚缺乏低食盐浓度对水产品脂肪氧化具有抑制作用的相关报道，但是有研究表明，在猪肉和牛肉中添加不同浓度的NaCl会导致不同程度的促氧化或抗氧化作用，而低食盐浓度对肌肉类食品的抗氧化作用的具体机理尚不明确，有待进一步探讨[19-21]。

双因素方差分析结果见图4。图4显示，冷藏时间(P=0.002 8)以及食盐添加量(P=0.002 5)对鱼肉中丙二醛含量具有显著性影响，且两个因素之间的影响没有显著的交互作用(P=0.329)。由图4(a)可知，冷藏13 d后鱼肉中丙二醛含量[n=12, (0.52±0.47) mg/kg]显著高于冷藏1 d[0.12±0.07) mg/kg]和6 d[(0.30±0.26) mg/kg]后的鱼肉，意味着冷藏13 d后的鱼肉的脂肪氧化程度显著高于冷藏1～6 d后的鱼肉，其品质明显下降，这一变化趋势与鱼肉冷藏期间pH值的变化相一致。食盐浓度对鱼肉中丙二醛含量影响的单因素方差分析结果见图4(b)，添加5.0% NaCl的鱼肉中丙二醛含量[n=9, (0.60±0.54) mg/kg]显著高于其他组[(0.14～0.34) mg/kg]，意味着5.0%的加盐处理具有显著的促氧化作用；尽管添加2.5% NaCl的鱼肉中丙二醛的平均值比空白对照组高89%, 而添加0.5% NaCl的鱼肉中丙二醛平均值比对照组低25%，但因样品的差异性较大，这3组不同食盐处理的鱼样中丙二醛含量没有显著性差异。

不同字母代表显著性差异(P<0.05)。图4 食盐添加量和冷藏时间对草鱼白肌丙二醛含量的影响Fig.4 Effects of salt addition and cold storage time on malondialdehyde content of white muscle from grass carp

2.5 食盐添加量对冷藏过程中鱼肉TVB-N含量的影响以及TVB-N变化的动力学分析

图5 食盐添加量和冷藏时间对不同批次草鱼白肌TVB-N含量的影响Fig.5 Effects of salt addition and cold storage time on TVB-N content in white muscle from different batches of grass carp

水产品在贮藏过程中，因酶或微生物的作用，使得蛋白质分解产生挥发性氨和胺类等含氮碱性化合物，因此TVB-N 值常用于评价水产品的鲜度，以反映水产品的腐败情况[22]。不同食盐添加量和冷藏时间对不同批次草鱼白肌TVB-N含量的影响见图5。图5显示，添加不同食盐浓度的3批不同鱼肉的TVB-N值均随冷藏时间的延长而上升, 冷藏6 d和13 d后鱼肉TVB-N平均值分别为冷藏1 d后的1.3～1.6倍和2.1～2.9倍；另外，NaCl含量越高，鱼肉储藏过程中TVB-N值升高的程度越小，经过0.5%、2.5%、5.0%加盐处理的鱼肉，冷藏6 d后的TVB-N平均值分别比对照组降低7%、18%和26%，而冷藏13 d后，比对照组分别降低12%、37%、42%。食盐的添加(即使只加入0.5%)使得鱼肉在冷藏过程中的TVB-N含量降低，这与邢云霞等(3%～9% NaCl)[10]、汪之颖等(2% NaCl)[12]的研究结果相一致，主要是因为NaCl的加入导致水分活度降低和渗透压的提高，从而抑制了微生物的生长以及相关酶的活性。

双因素方差分析结果显示，冷藏时间(P<0.000 1)以及食盐浓度(P<0.000 1)对鱼肉的TVB-N含量都具有显著影响，而且两个因素对鱼肉的TVB-N含量的影响具有显著的交互作用(P<0.000 1)。

因冷藏时间及食盐浓度对3个不同批次的鱼肉中TVB-N含量的影响效果相当接近(图5)，且鱼肉的TVB-N含量随冷藏时间的延长而持续增加，为进一步对冷藏期间含不同食盐浓度鱼肉中TVB-N含量变化的特点进行量化，采用了0～2级动力学反应方程式对鱼肉在冷藏期间TVB-N的生成速率进行拟合，结果见表1。从中可看出，鱼肉在冷藏期间TVB-N值的变化符合一级反应动力学模型(R2为0.970 1～1.000 0)。另外，不同食盐添加量对冷藏过程中草鱼白肌TVB-N含量变化的一级反应拟合方程的速率常数的影响见图6。图6显示，3批不同鱼样的反应速率常数存在较大的差异，但是对于每一批次的鱼肉，其反应速率常数都随着食盐浓度的增加而降低，3批鱼样在不同食盐浓度处理下k值的平均值分别为(0.080 7±0.006 5) d-1(0.5% NaCl)、(0.054 6±0.009 5) d-1(2.5% NaCl)、(0.049 8±0.009 6) d-1(5.0% NaCl)，与对照组相比[(0.089 4±0.003 9) d-1(0% NaCl)]，k值的平均值分别减低10%(0.5% NaCl), 39%(2.5% NaCl)和44%(5.0% NaCl)。

表1 冷藏期间草鱼白肌的TVB-N含量变化的动力学拟合模型的线性相关系数

图6 食盐添加量对冷藏过程中草鱼白肌TVB-N含量变化的一级反应拟合方程的速率常数的影响Fig.6 Effects of salt addition on rate constant of 1st order reaction model for change of TVB-N in white muscle of grass carp during cold storage

3 结 论

在冷藏条件下，草鱼白肌中的水分、蛋白质和脂肪含量较为稳定。在零度冷藏条件下，鱼肉的失水率较低。食盐浓度和冷藏时间对鱼肉的L*、a*、b*值的影响很小，这主要与本实验中采用的鱼肉样品色素含量低和成分相对简单有关。冷藏时间和NaCl浓度对鱼肉的pH值、丙二醛和TVB-N含量具有显著影响，且冷藏时间和食盐浓度对鱼肉的pH值和丙二醛含量的影响没有显著的交互作用。添加2.5%和5.0%的食盐使得冷藏期间鱼肉的pH值显著低于空白对照(0% NaCl)，同时使得丙二醛含量的平均值分别高于相应对照组28%～189%和120%～322%，意味着2.5%～5.0%的食盐具有促进脂肪氧化的作用；但是含0.5%食盐的鱼肉在冷藏6 d和13 d后，其丙二醛含量的平均值分别比对照组低18%和31%，表明低浓度食盐对脂肪氧化有一定的抑制作用。鱼肉的TVB-N含量随冷藏时间的延长而持续增加，其变化符合一级反应动力学模型(R2为0.970 1～1.000 0)，且反应速率常数(k值)随着食盐浓度的增加而降低, 与对照组相比[k=(0.089 4±0.003 9) d-1]，k值的平均值分别降低10%(0.5% NaCl)，39%(2.5% NaCl)和44%(5.0% NaCl)。