黎楚怡，熊新威，杜晓东,2

马氏珠母贝双链RNA干扰实验条件优化

黎楚怡1，熊新威1，杜晓东1,2

（1.广东海洋大学水产学院//2.广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524088）

【】优化马氏珠母贝（）双链RNA干扰实验的条件。注射不同次数的干扰探针进行不同时间的干扰，通过实时荧光定量检测基因的表达；通过扫描电子显微镜观察贝壳珍珠层内表面新生层的生长并分析不同组别贝壳的生长情况。注射60 μg探针1次时，实验组基因在外套膜套膜区相对表达量显著低于对照组，且实验组基因6 d的相对表达量显著低于4 d；注射60 μg探针2次时，8 d基因在外套膜套膜区的相对表达量显著低于对照组。扫描电子显微镜观察结果表明，所有实验组贝壳珍珠层均出现无序生长；与实验组4 d和8 d相比，6 d时新生珍珠层新生层边界完全被破坏，并且出现更多散乱的细小晶体。注射60 μg双链RNA探针1次并在6 d后收集样品，为马氏珠母贝双链RNA干扰实验探究基因功能的稳定高效条件。

马氏珠母贝；双链RNA干扰；优化

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子在转录水平诱发的基因沉默现象[1]。RNA干扰的作用机理：（1）起始阶段：外源dsRNA被Dicer酶切割成大小约21 ~ 23 bp的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）；（2）效应阶段：siRNA双链结合核酶复合物，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC中siRNA变性解开双链，反义链结合在复合物上，并引导RISC与同源的靶mRNA结合，在核酸内切酶的作用下，自siRNA中点位置处将靶mRNA切断，阻断其翻译成蛋白质[2-3]；（3）扩增阶段：以siRNA中的一条链为引物、靶mRNA为模板，在RNA介导的RNA聚合酶作用下，扩增靶mRNA，产生新的siRNA反作用于靶mRNA，使其降解[3]。……