何家垣，蒋壮飞，马蓉蓉，杨莉莉，李清瑶，谭玲，陈志涛，张起辉

（1 重庆大学化学化工学院，重庆400044； 2 重庆大学药学院，重庆400044）

引 言

红车轴草（Trifolium pretense L.）药用价值高，其提取物中富含芒柄花黄素、大豆素和鹰嘴豆芽素等多种黄酮类成分[1−4]。其中，芒柄花黄素具有预防癌症、抗动脉粥样硬化和抗氧化等作用[5−7]，还具有预防前列腺癌[8−10]和结肠癌[11]等药理活性。作为黄酮类化合物，芒柄花黄素不但能够防治多种癌症和炎症，而且还表现出更为广泛的药理作用和低毒性。然而，目前主要采用制备液相色谱和柱色谱来进行芒柄花黄素的分离和预富集，而这些方法步骤烦琐，且分离成本较高，这将会直接限制其在医药领域的应用[12−13]。

分子印迹聚合物（MIPs）是一种预设性固相吸附剂[14−17]，其制备过程简便，拥有良好的稳定性及较高的特异性吸附能力，特别适用于分离和富集中药天然产物中的特定种类的物质[18−20]。环境响应型MIPs 的溶解性、聚合物连接方式和表面结构会对所处环境中pH、磁性、光、温度以及电等信号的改变做出响应，因此会对吸附物质表现出不同的吸附效果[21−27]。环境响应型MIPs 中温度响应MIPs 与磁响应MIPs 应用广泛，目前已成功应用在药物传输、色谱分离以及传感器等领域[28−29]。

磁性分子印迹聚合物（MMIPs）是通过在磁性纳米颗粒如Fe3O4或γ−Fe3O4的表面上涂覆MIP 膜来制备的，从而使MMIPs 结合了分子识别和快速磁分离的优点[30]。此外，热响应分子印迹聚合物可以通过环境温度变化来实现目标分子的选择性识别和释放。聚N−异丙基丙烯酰胺（pNIPAM）被认为是一种热响应性聚合物，并表现出优异的热响应性，这是由于在33℃左右最低共溶温度（LCST）附近存在可溶（亲水）−不溶（疏水）可逆转变[31]。NIPAM 的热响应行为可用于设计智能MIP，这可能是根据温度变化更有效地吸附和释放模板分子的理想方法[32]。

本文以纳米Fe3O4作为支撑材料，模板选用芒柄花黄素，温敏功能单体和辅助功能单体分别选用N−异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和甲基丙烯酸（MAA），制备出磁性和温度双响应型分子印迹材料（MTMIPs），随后对MTMIPs 形貌进行表征，并结合高效液相色谱法（HPLC）将其用于芒柄花黄素的定向萃取研究中，为探究新的天然产物富集方法奠定基础。

1 实验材料和方法

1.1 实验药材

红车轴草药材购买于北京同仁堂（保存于保干器内）。

1.2 MTMIPs制备

1.2.1 Fe3O4纳米粒子的合成 磁性Fe3O4的合成方法为溶剂热法[33]，具体操作步骤如下：量取30 ml 乙二醇于单颈烧瓶，加入1.35 g FeCl3·6H2O，磁力搅拌，形成溶液；然后将其放置于油浴锅内，加入400 mg 柠檬酸钠与3.1 g 无水醋酸钠，150℃的条件下磁力搅拌0.5 h；停止反应后移入反应釜中于200℃烘箱内反应8 h。终止反应后用去离子水和乙醇反复多次洗涤Fe3O4产物,洗至中性后真空干燥（50℃）8 h。

1.2.2 制备Fe3O4@SiO2纳米粒子 配制无水乙醇和超纯水的混合溶液（4∶1，体积比）50 ml 于单颈烧瓶，加入0.1 g Fe3O4纳米粒子后超声20 min；随后加入1 ml NH3·H2O 与500 mg 正硅酸乙酯于上述溶液中，冰水浴条件下超声60 min。终止反应后，用水和乙醇反复多次洗涤Fe3O4@SiO2产物，洗至中性后真空干燥（50℃）8 h。

1.2.3 制备磁性温敏分子印迹材料（MTMIPs） 准确称取90 mg 芒柄花黄素超声溶于900 μl 二甲亚砜中，形成溶液；随后加入70 mg MAA、0.1 g NIPAM 与150 ml 乙醇后超声溶解，避光反应12 h；加入0.2 g Fe3O4@SiO2室温振荡60 min，再加入0.8 g 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）与0.12 g 引发剂偶氮二异丁腈，摇匀后充氮气保护，放置于恒温振荡摇床上，先后在40℃和60℃的条件下分别反应6 h 和18 h。终止反应后，利用外加磁场分离产物，随后用洗脱液（甲醇−醋酸，9∶1，体积比）反复多次洗脱模板芒柄花黄素，随后将聚合物用甲醇和水洗至中性，真空干燥（45℃）后将制备好的TMMIP 密封保存，上述步骤如图1所示。

图1 磁性温敏MTMIPs的合成过程Fig.1 Schematic diagram of the synthesis process of magnetic temperature−sensitive MTMIPs

非分子印迹聚合物（MTNIPs）的制备过程同上所述，唯一差别是在制备MTNIPs 的过程中不加入模板分子。

1.3 吸附实验

1.3.1 温敏性能考察 以80%甲醇为溶剂溶解芒柄花黄素标准品配制芒柄花黄素标准溶液（20～400 μg/ml），分 别 向 其 中 加 入3 mg MTMIPs 和3 mg MTNIPs，在摇床上以90 r/min的转速，分成三组（25、35、45℃）平行吸附12 h。吸附终止后，在磁场的作用下分离材料后取上清液过滤待测，每组平行实验三次。HPLC 进行定量分析，通过测定上清液中芒柄花黄素浓度和其初始浓度，分别求得各组MTMIPs与MTNIPs的吸附量。计算公式如式（1）：

式中，Q 为吸附量，mg/g；C0为芒柄花黄素初始浓度，μg/ml；Ce为平衡后上清液中芒柄花黄素的浓度，μg/ml；V 为加入的芒柄花黄素标准溶液体积，ml；m为加入的印迹材料的质量，mg。

1.3.2 静态吸附实验 以80%甲醇为溶剂溶解芒柄花黄素标准品配制芒柄花黄素标准溶液（20～400 μg/ml），分 别 向 其 中 加 入3 mg MTMIPs 和3 mg MTNIPs，在恒温振荡摇床上以90 r/min 的转速、35℃的条件下吸附12 h。吸附终止后，在磁场的作用下分离材料后取上清液过滤待测，每组平行实验3次。HPLC 进行定量分析，通过滤液和母液中的芒柄花黄素浓度，利用式（1）分别求得MTMIPs 与MTNIPs的吸附量。

1.3.3 吸附动力学实验 以80%甲醇溶液为溶剂配制80 μg/ml 的芒柄花黄素标准溶液，分别向其中加入3 mg MTMIPs和3 mg MTNIPs，在恒温振荡摇床上以90 r/min 的转速，在35℃的条件下，分别振荡5、10、20、30、40、60、80 和100 min。吸附终止后，在磁场作用下分离材料后取上清液过滤待测，每组平行实验3次。HPLC进行定量分析，通过滤液和母液中的芒柄花黄素浓度，利用式（2）分别求得MTMIPs 和MTNIPs的吸附量。计算公式如式（2）：

式中，Q 为聚合物的吸附量，mg/g；Ct为吸附后模板浓度，μg/ml；C0为初始模板分子浓度，μg/ml；V为芒柄花黄素标准溶液的体积，ml；m为加入的印迹材料的质量，mg。

1.4 选择性实验

选取大豆苷元和染料木素为竞争性干扰物质，考察制备的聚合物对芒柄花黄素的选择性以及特异性吸附能力。将3 mg MTMIPs 或3 mg MTNIPs 加入含有80 μg/ml 大豆苷元、芒柄花黄素和染料木素的混合溶液中，随后放置于摇床（35℃，90 r/min）上吸附12 h。终止吸附后，在磁场作用下分离材料后取上清液过滤待测，每组平行实验三次，HPLC 进行定量分析。

1.5 红车轴草提取及MTMIPs的应用

1.5.1 红车轴草提取 将100 ml 的70%乙醇加入到20 g已过二号筛的药材干燥粉末中，提取3次，过滤后取滤液继续用等体积量的石油醚连续萃取3次，减压蒸馏上层溶液，浓缩得浸膏。甲醇溶解浸膏待用。大孔树脂（D101）装柱，取上述浸膏溶液上柱，吸附后依次用20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液进行洗脱，而后选取60%乙醇的洗脱液，将其进行减压浓缩即得浸膏。

1.5.2 MTMIPs 的实际应用 取6 mg 浸膏溶于3 ml甲醇中，加入10 mg MTMIPs，在恒温振荡摇床（35℃）上以90 r/min的转速吸附12 h。终止吸附后，利用外加磁场将聚合物材料与溶液分离开。用1 ml洗脱液（甲醇−醋酸，9∶1，体积比）超声1 min 洗脱MTMIPs，重复三次，合并上述洗脱液，再利用HPLC进行定量分析。

1.5.3 HPLC 分析 HPLC 分析条件：Agilent 1260，色谱柱为TC−C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm)，进样量为10 μl，流速0.6 ml/min，柱温30℃，以水（A）和甲醇（B）作为流动相梯度洗脱，0～35 min, 55%～75% B;35～40 min,75%～95%B;40～45 min,95%～55%B。

2 实验结果与讨论

2.1 MTMIPs的形貌表征

Fe3O4@SiO2纳米粒子和MTMIPs的SEM、TEM表征图如图2 所示。由图2(a)可知Fe3O4@SiO2纳米粒子粒径较均一（250 nm），表面光滑度较高，呈现为单分散的球形颗粒。包裹聚合层后，MTMIPs 呈现为表面较粗糙的球形颗粒，大小粒径相对均匀，直径约450 nm[图2(b)]。由图2(c)可知，制备得到的MTMIPs 核壳结构明显，可以清晰看到100 nm 左右的SiO2壳层已经成功均匀地包裹在磁性Fe3O4核上。

2.2 MTMIPs的结构特性

2.2.1 红外光谱分析 Fe3O4@SiO2与MTMIPs 的FT−IR图如图3(a)，图中1095 cm−1处出现SiO2壳层中Si—O 的 伸 缩 振 动 峰，且591 cm−1处 有Fe3O4核 中Fe—O 的伸缩振动峰，图中证据表明载体Fe3O4已成功包裹上SiO2。MTMIPs红外光谱图中，1730 cm−1处的峰为EGDMA 中C O 的伸缩振动峰，这表明EGDMA 已经成功包裹在材料表面，MTMIPs 成功合成。

2.2.2 TGA 分析 图3(b)是MTMIPs 的热重分析（TGA）曲线。刚开始MTMIPs 的质量减少了5.02%（25～400℃），这是由MTMIPs 中以物理方式结合水分与游离水分的损失所致[34]。100～240℃时MTMIPs质量损失非常少，表明此温度范围内，MTMIPs 非常稳定。240～500℃，MTMIPs质量损失约为75%，是由该印迹材料表面的有机物完全分解所致。因此证实制备得到的MTMIPs的热稳定性良好。

2.2.3 磁学性质表征 Fe3O4和MTMIPs磁化曲线如图3(c)所示。Fe3O4与MTMIPs 纳米粒子均具有超顺磁性，由图可知其饱和磁化强度为Fe3O4（61.91 emu/g）与MTMIPs（5.33 emu/g）。在 磁 场 的 作 用 下，MTMIPs 从样品基质中分离仅需50 s，证明MTMIPs适用于磁性萃取分离。

2.2.4 X 射线衍射表征 在Fe3O4的XRD 谱图中，2θ=62.87°,53.39°,43.17°,43.17°,35.66°,30.45°处的峰分别为Fe3O4纳米粒子（440）、（511）、（422）、（400）、（311）、（220）晶面衍射特征峰[35]。Fe3O4经二氧化硅修饰后以及MTMIPs的XRD谱图的特征衍射峰未消失，并且没有出现其他杂质峰，证明在MTMIPs 的合成过程中，纳米Fe3O4的晶体结构没有被破坏。

2.3 MTMIPs的温敏性考察

图2 Fe3O4@SiO2和MTMIPs 电镜表征图：Fe3O4@SiO2扫描电镜图（a）；MTMIPs 扫描电镜图（b）；MTMIPs 透射电镜图（c）Fig.2 SEM images of Fe3O4@SiO2NPs(a),MTMIPs(b),and TEM of MTMIPs(c)

图3 MTMIPs与Fe3O4@SiO2的FT−IR图（a）；MTMIPs 的TGA分析曲线（b）；MTMIPs与Fe3O4的磁性分析（VSM）曲线（1 Oe=79.5775 A/m）（c）；Fe3O4、MTMIPs与Fe3O4@SiO2的XRD谱图（d）Fig.3 FT−IR spectra of MTMIPs and Fe3O4@SiO2(a);TGA analysis curves of MTMIPs(b);Magnetization curves of MTMIPs and Fe3O4 nanoparticles(c);XRD pattern of Fe3O4,Fe3O4@SiO2 and MTMIPs nanoparticles(d)

图4 MTMIPs的温敏吸附图Fig.4 Temperature−sensitive adsorption spectra of MTMIPs

MTMIPs 温敏吸附曲线如图4 所示。当聚合物材料吸附达到平衡后，MTMIPs 不同温度下的吸附量为11.34 mg/g（25℃）、16.43 mg/g（35℃）和9.31 mg/g（45℃）。35℃时MTMIPs的吸附量明显优于25℃和45℃；45℃条件下的吸附量最小。最大吸附容量在35℃时达到，接近聚N−异丙基丙烯酰胺（pNIPAM）的最低共溶温度(LCST)33℃，这是因为此时聚合物的空腔达到了印迹状态。当温度降至低于LCST 的25℃时，TMMIPs 具有高度亲水性，水分子容易扩散到TMMIPs 中，导致聚合物溶胀，因此，模板和聚合物之间的距离随着氢键相互作用的减弱而增加；但是，当温度达到比LCST 高的45℃时，聚合物具有相同的趋势，因为与35℃相比，其吸附量较小，因此，聚合物变得疏水和收缩，导致塌陷状态。由于吸附效率的原因，以下实验选择了35℃作为最佳温度。上述结果证明制备得到的MTMIPs 纳米粒子具有明显的温敏吸附特性，适用于温敏型萃取分离。

2.4 MTMIPs的静态吸附

MTMIPs 和MTNIPs 的静态吸附实验发现合成的聚合物芒柄花黄素的吸附量随着芒柄花黄素初始浓度的增加而增加。当聚合物材料的吸附达到动态平衡后，平衡时MTMIPs 的吸附量16.43 mg/g 是MTNIPs（6.96 mg/g）的2.4 倍。这表明MTMIPs 表面形成的模板分子特异性空穴对其更高吸附量提供了贡献。

Langmuir 与Freundlich 方程用于上述实验结果的拟合分析，方程如式(3)～式(4)所示：

式中，Qe为MTMIPs 和MTNIPs 平衡时的吸附量，mg/g；Ce为模板分子的浓度，mg/g；Qm为材料的最大吸附量，mg/g。得到的平衡常数和相关参数如表1 所示，Langmuir 模型相较于Freundlich 模型有更高的R2（0.994），因此本文制备得到的MTMIPs 更符合Langmuir 吸附模型，通常Langmuir 模型被认为是单层吸附理论，而Freundlich 模型则被认为是单层吸附和多层吸附相结合，表明本实验的MTMIPs 对模板分子的吸附是以单层吸附为主要吸附方式的复杂吸附。

表1 等温吸附模型拟合参数Table 1 The fitting parameters of isothermal adsorption model

2.5 MTMIPs的动力学特性

MTMIPs 和MTNIPs 的吸附动力学分析发现MTMIPs 和MTNIPs 对芒柄花黄素的吸附量随着时间的增加而增加。经过1 h 的吸附过程MTMIPs 和MTNIPs 全部达到平衡吸附。相较于MTNIPs，由于MTMIPs 具有特异性的模板分子空穴，其花费更长时间达到吸附平衡，此外MTMIPs 对芒柄花黄素的吸附量远高于MTNIPs，表明MTMIPs 对靶标分子具有更大的亲和力。

进一步对MTMIPs 和MTNIPs 进行二级动力学数据模拟，结果如式(5)～式(6)

式中，K1代表一级动力学常数，min−1；K2代表二级动力学常数，g/(mg·min)；t 代表吸附时间，min；Qe和Qt分别代表在平衡时的吸附量和时间t 的最大吸附量，mg/g。相关参数如表2所示，相较于准一级动力学，准二级动力学具有较高的相关系数，更符合MTMIPs 对芒柄花黄素的吸附。这也进一步表明，化学吸附是MTMIPs吸附过程中的决速步骤。

表2 吸附动力学模型拟合参数Table 2 The fitting parameters of adsorption kinetics model

2.6 MTMIPs的选择性实验及方法学考察

2.6.1 选择性实验 MTMIPs 和MTNIPs 对芒柄花黄素的选择性考察如图5 所示，选取芒柄花黄素及其结构类似物如染料木素和大豆苷元等作为竞争性吸附物质。从图中可知，MTMIPs 对芒柄花黄素的吸附量（6.91 mg/g）最大，计算得到印迹材料对芒柄花黄素、染料木素和大豆苷元的印迹因子（imprinting factor，IF=QMIP/QNIP,QMIP和QNIP分别为MIP和NIP 对目标物质的吸附量）分别为1.56、1.15、0.83，其中印迹材料对芒柄花黄素的印迹因子最高，表明MTMIPs 对芒柄花黄素具有选择性吸附特性。而MTNIPs 由于对芒柄花黄素没有选择性，所以其对芒柄花黄素、大豆苷元以及染料木素的吸附量差别没有MTMIPs大。

2.6.2 选择性研究的方法学考察 表3列出了本实验选择性研究的方法学考察数据，日间和日内精密度、标准曲线及线性范围、定量限（LOQ）和检出限（LOD）以及相关系数如表所示。由表可知，MTMIPs的选择性实验中模板分子及其结构类似物的线性范围为5～100 μg/ml，相关系数都大于0.99。

表3 选择性研究中的方法学考察数据Table 3 Data of methodological examination in selective research

图5 MTMIPs选择性考察的HPLC图（a）;MTMIPs和MTNIPs对芒柄花黄素、染料木素和大豆苷元选择性考察（b）Fig.5 HPLC diagrams of MTMIPs selectivity study(a);Selection adsorption of formononetin,genistein and daidzein by MTMIPs and MTNIPs(b)

3 MTMIPs的实际应用

红车轴草粗提物用MTMIPs 萃取后的分析结果如图6 所示。制备的MTMIPs 纳米粒子萃取粗提物后，洗脱液中芒柄花黄素的液相峰相较其他液相峰明显，且萃取后粗提物中其他液相峰未发现有明显变化，说明磁性温敏聚合物MTMIPs 能够选择性地从粗提物中萃取目标物质，具备从复杂基质中特异性磁性萃取分离模板芒柄花黄素的特性。

图6 MTMIPs实际应用HPLC图：（1）芒柄花黄素母液HPLC图;（2）洗脱液的HPLC图;（3）粗提物经萃取后的HPLC图;（4）粗提物的HPLC图Fig.6 HPLC diagrams of the MTMIPs practical application:(1)HPLC diagram of the formononetin mother solution;(2)The HPLC diagram of MTMIPs eluents;(3)HPLC diagram of crude extracts after MTMIPs absorbed;(4)HPLC diagram of crude extracts from Trifolium pratense L.

4 结 论

本研究采用磁性和温度环境响应策略，以低成本和绿色化学理念，利用表面分子印迹技术成功制备出具有芒柄花黄素特异性识别能力的磁性温敏分子印迹材料MTMIPs，该聚合物具有良好的磁性、热稳定性以及温敏特性，具有较强的选择性。文中利用MTMIPs 成功实现了从红车轴草粗提物复杂体系中，高效富集和分离目标化合物芒柄花黄素，表明MTMIPs 可用于复杂基质中目标物质的选择性磁性萃取分离，具有较高的实用前景。综上所述，本文为研究中药材中的天然活性成分提供了一种良好的固相萃取填料。