胡美思 张文达 任艳玲

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是以女性绝经后雌激素分泌减少、骨转换加速和易发骨折为特点的一类骨质疏松，临床伴有骨量快速降低与骨髓脂肪异常积累[1-3]。成骨、脂肪细胞以竞争的方式由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化形成，且两者分化呈“此消彼长”的趋势[4-5]。BMSCs骨向与脂向分化不均与PMOP病理相关。大量研究表明[6-7]，抑制BMSCs脂向分化，促进骨向分化，调节骨-脂分化平衡能够改善骨丢失。左、右归丸是“阴阳互济”代表方，既往研究[8]表明，左、右归丸均能抑制去卵巢大鼠脂向分化，促进骨形成，但改善机制尚不明确。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是机体能量感受器，通过感应机体能量状态而被激活，以参与调节脂质、蛋白质合成，自噬等生命过程[9]。本研究将通过AMPK/mTOR通路初步探讨左、右归丸对PMOP模型大鼠股骨脂向分化的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：60只SD雌性未生育大鼠[许可证号：SCXK(京)2014-0010]，SPF级，2月龄，体重200～220 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，并于辽宁中医药大学动物实验中心饲养。

1.1.2试剂与仪器:SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒(WLA013)、AMPKα抗体(WL02254)、mTOR抗体(WL02477)、p-mTOR抗体(WL03694)、PPARγ抗体(WL01800)、C/EBPα抗体(WL02959)、C/EBPβ抗体(WL0 056 A)、内参β-actin(WL01845)均由wanleibio提供；p-AMPKα抗体(ab133448，abcam)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time,RR036 A，Takara)；SYBR Premix Ex TaqTMII(RR820，Tli RNaseH Plus)；酶标仪(BIOTEK)； Trizol(135306，Ambion),荧光定量PCR仪(CG-05，Heal Force)；Micro 17R微量台式离心机(美国Thermo公司)；电泳仪(DYY-7C)与转移槽(DYCZ-40D)均由北京六一公司提供；数字化全身骨密度仪(STRATOS DR,法国，Diagnostic Medical System SA)。

1.2 方法

1.2.1造模及分组：大鼠适应性喂养1周，随机分为空白组(KB)、假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、补佳乐组(Estradiol Valerate,BJL)，共6组。除KB组外，其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)进行麻醉，SHAM组大鼠摘除双侧卵巢周围等量脂肪，剩余大鼠从背部摘除双侧卵巢，建立PMOP模型大鼠，除造模、灌胃等原因导致大鼠死亡12只，取材时纳入大鼠48只，每组8只。

1.2.2药物制备与给药剂量：戊酸雌二醇片(商品名：补佳乐，批号：国药准字J20130009，DELPHARM Lille S.A.S.)用蒸馏水制备为0.1 mg/L的药液。左归丸：熟地黄24 g，炒山药12 g，鹿角胶12 g(烊化)，菟丝子12 g(包煎)，山萸肉12 g，枸杞子12 g，牛膝9 g，龟板胶12 g(烊化)。右归丸：熟地黄24 g，炒山药12 g，菟丝子12 g(包煎)，附子6 g(先煎)，山茱肉12 g，肉桂6 g，枸杞子12 g，杜仲9 g，当归9 g，鹿角胶12 g(烊化)。左、右归丸生药购于辽宁中医药大学附属第一医院，经中药饮片质量管理小组进行质量鉴定，自制成水煎液(生药量：1 g/mL)。造模3 d后，大鼠灌胃给药，KB、SHAM、OVX、ZGW、YGW、BJL组灌胃剂量分别为：蒸馏水1.0 g/kg、蒸馏水1.0 g/kg、蒸馏水1.0 g/kg、左归丸9.69 g/kg、右归丸10.52 g/kg、补佳乐药液9×10-5g/kg，每周连续灌胃6 d，休息1 d，每天灌胃1次，连续给药12周。

1.2.3检测大鼠右侧股骨骨密度：大鼠取材前，采用乙醚麻醉，应用数字化全身骨密度仪(型号STRATOS DR,法国)检测各组大鼠右侧股骨骨密度(bone mineral density，BMD)，采用DEX数字立体扇扫，结合双能X射线吸收和二维扇束成像技术，通过自动病人屏幕观察定位技术(Easy Scan)直接探测，检测速度3 min/全身，分辨率400 μm，峰值电压43-70KeV,激光指示器波长670 nm。仪器由辽宁中医药大学慢性病医院康复中心提供,扫描时无介质。

1.2.4实时荧光定量PCR法检测mRNA的表达：采用实时荧光定量PCR法检测大鼠右侧股骨干骺端PPARγ、AMPK、mTORC1 mRNA的表达，每组3只。Trizol 法提取骨组织总RNA，反转录合成cDNA，引物序列由Takara公司合成：GAPDH上游引物5’-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’，下游引物5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’；PPARγ上游引物：5’TTGATTTCTCCAGCATTTC-3’，下游引物5’-TGATCGCACTTTGGTATT-3’；AMPK上游引物5’TTCGGGAAAGTGAAGGTGGG-3’，下游引物5’-TCTCTCTGCGGATTTTCCCG-3’；mTORC1上游引物5’-AGGACCAGAAGAAGGGTGTG-3’，下游引物5’-GAAAAGTTACATGCCGGGCT-3’。反转录条件：37 ℃，15 min，85 ℃，5 s。按照荧光定量PCR试剂盒配置反应体系，设置PCR热循环参数:95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;60 ℃，30 s收集荧光(40个循环)。结果用相对定量法:2-△△CT法计算目的mRNA相对表达量。

1.2.5Western blot法检测蛋白的表达：采用Western blot法检测大鼠右侧股骨干骺端PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR蛋白的表达，每组3只。液氮研磨骨组织，称取0.2 g，加入相应体积裂解液充分研磨。提取蛋白，取上清液，加入等量上样缓冲液以蛋白变性。进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样等量蛋白，电压80 V，恒压电泳2.5 h。转印、封闭，封闭条件：37 ℃水浴震荡1 h。孵育一抗、二抗，一抗蛋白浓度分别为：1∶500、1∶500、1∶500、1∶500、1∶2 000、1∶500、1∶500;二抗孵育条件：37 ℃水浴震荡45 min。洗膜、底物发光。用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析条带的灰度值。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 左、右归丸对PMOP大鼠右侧股骨BMD的影响

与KB组比较，OVX组大鼠BMD显著降低(P<0.01)，成功制备PMOP模型大鼠；与OVX组比较，ZGW、YGW、BJL组大鼠BMD明显升高(P<0.01)；与ZGW组比较，YGW、BJL组大鼠BMD没有差异(P>0.05)。见表1。

表1 左、右归丸对PMOP大鼠右侧股骨BMD的影响

2.2 左、右归丸对PMOP大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白以及PPARγ mRNA与蛋白表达的影响

2.2.1左、右归丸对PMOP大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达的影响：与KB组比较，OVX组大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达明显升高(P<0.01)；与OVX组比较，ZGW、YGW、BJL组大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达降低(P<0.01)；与ZGW组比较，YGW、BJL组大鼠股骨C/EBPα蛋白表达没有差异(P>0.05)；与ZGW组比较，YGW组大鼠股骨C/EBPβ蛋白表达明显升高(P<0.01)，BJL组大鼠股骨C/EBPβ蛋白表达没有显著差异(P>0.05)。见图1。

图1 左、右归丸对PMOP大鼠股骨C/EBPα、C/EBPβ蛋白表达的影响注：与KB组比较，▼▼P<0.01；与OVX组比较，◇◇P<0.01；与ZGW比较，△△P<0.01。Fig.1 Effect of Zuo/Yuo pills on C/EBPα and C/EBPβ proteins expression in PMOP rat femur

2.2.2左、右归丸对PMOP大鼠股骨PPARγ mRNA与蛋白表达的影响：与KB组比较，OVX组大鼠股骨PPARγ mRNA与蛋白表达明显升高(P<0.01)；与OVX组比较，ZGW、YGW、BJL组大鼠股骨PPARγ mRNA与蛋白表达明显降低(P<0.01或P<0.05)；与ZGW组比较，YGW、BJL组大鼠股骨PPARγ mRNA表达明显升高(P<0.01)；与ZGW组比较，YGW组大鼠股骨PPARγ蛋白表达明显升高(P<0.05)，BJL组大鼠股骨PPARγ蛋白表达没有显著差异(P>0.05)。见图2。

图2 左、右归丸对PMOP大鼠股骨PPARγ mRNA与蛋白表达的影响Fig.2 Effect of Zuo/Yuo gui pills on PPARγ mRNA and protein expression in PMOP rat femur注：与KB组比较，▼▼P<0.01；与OVX组比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01；与ZGW比较，△△P<0.01。

2.3 左、右归丸对PMOP大鼠股骨AMPK/mTOR信号通路的影响

2.3.1左、右归丸对PMOP大鼠股骨AMPK mRNA的表达与蛋白磷酸化水平的影响：与KB组比较，OVX组大鼠股骨AMPK mRNA表达明显升高(P<0.01)；与OVX组比较，ZGW、YGW、BJL组大鼠股骨AMPK mRNA表达明显降低(P<0.01)；与ZGW组比较，YGW、BJL组大鼠股骨AMPK mRNA表达明显升高(P<0.01)。与KB组比较，OVX组大鼠股骨AMPKα磷酸化水平明显升高(P<0.01)；与OVX组比较，ZGW、YGW、BJL组大鼠股骨AMPKα磷酸化水平明显降低(P<0.01)；与ZGW组比较，YGW、BJL组大鼠股骨AMPKα磷酸化水平没有显著差异(P>0.05)。见图3。

图3 左、右归丸对PMOP大鼠股骨AMPK mRNA的表达与蛋白磷酸化水平的影响注：与KB组比较，▼▼P<0.01；与OVX组比较，◇◇P<0.01；与ZGW比较，△△P<0.01。Fig.3 Effect of Zuo/Yuo gui pills on AMPK mRNA expression and protein phosphorylation in PMOP rat femur

2.3.2左、右归丸对PMOP大鼠股骨mTOR mRNA的表达与蛋白磷酸化水平的影响：与KB组比较，OVX组大鼠股骨mTORC1 mRNA表达明显降低(P<0.01)；与OVX组比较，ZGW、YGW、BJL组大鼠股骨mTORC1 mRNA表达明显升高(P<0.01)。与ZGW组比较，YGW、BJL组大鼠股骨mTORC1 mRNA表达明显降低(P<0.01)。与KB组比较，OVX组大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.01)；与OVX组比较，ZGW、YGW、BJL组大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平明显升高(P<0.01或P<0.05)。与ZGW组比较，YGW组大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05)，BJL组大鼠股骨mTOR蛋白磷酸化水平没有显著性差异(P>0.05)。见图4。

图4 左、右归丸对PMOP大鼠股骨mTORC1 mRNA的表达与蛋白磷酸化水平的影响注：与KB组比较，▼▼P<0.01；与OVX组比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01；与ZGW比较，△P<0.05，△△P<0.01。Fig.4 Effect of Zuo/Yuo gui pills on mTORC1 mRNA expression and protein phosphorylation in PMOP rat femur

3 讨论

中医学认为，肾藏精化髓，决定身体的生长发育机能，具体体现在骨骼“生、长、壮、老、已”的改变。肾精亏虚，则生长发育机能衰退，骨组织出现相应病理性改变。绝经女性由于肾精亏虚，导致骨、脂代谢紊乱，主要表现为骨量快速下降，BMSCs脂向分化过度，骨髓脂肪异常堆积。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators activate receptor gamma,PPARγ)与CCAAT/增强子结合蛋白α、β(CCAAT/enhancer binding protein alpha and beta,C/EBPα、C/EBPβ)在形成脂肪方面发挥重要作用，CEBP/β能够诱导PPARγ早期表达，PPARγ诱导并协同C/EBPα调节成熟脂肪的形成[10]。

AMPK与mTOR存在于所有真核生物中，参与调节脂质合成、代谢[11-12]。AMPK是细胞能量检测与调控因子，当机体低能状态时被激活，活化的AMPK促进产生ATP的途径(脂肪分解)，并抑制消耗ATP的途径(蛋白质、脂质合成、mTOR信号通路等)以平衡机体能量的产生与消耗[13]。mTOR位于AMPK下游，是磷酸肌醇3激酶(PI3K)样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，有两种复合物mTORC1、mTORC2，其中，活化的mTORC1激活其下游效应分子核糖体S6K激酶1(P70S6k1)和真核翻译转录起始因子(4EBP-1)，参与调节蛋白质、脂质等的合成，是脂肪组织的调节信号通路[14]。小型GTP酶Rheb是RAS家族GTP结合蛋白的成员，位于mTOR上游，正向调节mTORC1，并位于TSC1/2下游，激活的TSC1/2使Rheb从活化状态(Rheb-GTP)转换为失活状态(Rheb-GDP)[15]。磷酸化是可逆的蛋白质翻译后修饰方式之一，低能状态下，激活的AMPK通过磷酸化T1227和S1 345位点激活TSC2，活化的TSC2抑制Rheb，进而抑制mTORC1及其下游P70S6k1和4EBP-1,以调节机体合成、代谢过程[16-17]。

左、右归丸出自《景岳全书·新方八阵》，是明代张介宾治疗肾精亏虚的名方。两方组成均含有熟地黄、山萸肉、山药、鹿角胶等，共有填精益髓之效，然两方在组方功效方面又有区别，左归丸在大量滋阴药熟地黄、龟板胶等中配伍少量补阳之菟丝子、鹿角胶，旨在“阳中求阴”，功效偏于滋补肾阴；右归丸则在温阳药附子、肉桂、鹿角胶等中配伍滋阴之熟地黄、山萸肉等，意在“阴中求阳”，功效偏于温补肾阳。课题组前期研究表明[8,18]，左、右归丸能够降低PMOP大鼠成脂分化，并且偏于滋肾阴的左归丸通过促进成骨分化同时降低成脂分化；而偏于温肾阳的右归丸，助阳以化气，加速脂质代谢运转，从而达到调节PMOP大鼠骨-脂分化平衡的作用。本次实验基于前期实验探究左、右归丸通过AMPK/mTOR通路干预PMOP大鼠成脂分化的作用机理。

本研究结果显示，OVX组大鼠股骨成脂分化相关基因与蛋白的表达明显升高，大鼠股骨AMPK mRNA的表达与蛋白磷酸化水平明显升高，mTORC1 mRNA的表达与蛋白磷酸化水平明显降低；经左、右归丸给药后，PMOP大鼠股骨成脂分化相关基因与蛋白的表达明显降低，AMPK mRNA的表达与蛋白磷酸化水平明显降低，mTOR mRNA的表达与蛋白磷酸化水平明显升高，提示左、右归丸可能通过干预AMPK/mTOR通路调节PMOP大鼠股骨成脂分化。然而，两方的调节作用亦有差异，其中，滋肾阴的左归丸可能通过降低AMPK mRNA的表达与蛋白磷酸化水平，升高mTOR mRNA的表达与蛋白磷酸化水平，从而降低PMOP大鼠股骨成脂分化；与左归丸相比，温肾阳的右归丸通过升高AMPK mRNA的表达，降低mTOR mRNA的表达与蛋白磷酸化水平，降低PMOP大鼠股骨成脂分化，并且左归丸降低大鼠股骨成脂分化的作用优于右归丸，这可能与左、右归丸调节AMPK/mTOR通路的差异有关。

本研究初步探讨了左、右归丸通过干预AMPK/mTOR通路调节PMOP模型大鼠股骨成脂分化，两方具体作用机制有待进一步研究。