胡美思 张文达 任艳玲

辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是以女性绝经后雌激素分泌减少、骨转换加速和易发骨折为特点的一类骨质疏松，临床伴有骨量快速降低与骨髓脂肪异常积累[1-3]。成骨、脂肪细胞以竞争的方式由骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化形成，且两者分化呈“此消彼长”的趋势[4-5]。BMSCs骨向与脂向分化不均与PMOP病理相关。大量研究表明[6-7]，抑制BMSCs脂向分化，促进骨向分化，调节骨-脂分化平衡能够改善骨丢失。左、右归丸是“阴阳互济”代表方，既往研究[8]表明，左、右归丸均能抑制去卵巢大鼠脂向分化，促进骨形成，但改善机制尚不明确。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是机体能量感受器，通过感应机体能量状态而被激活，以参与调节脂质、蛋白质合成，自噬等生命过程[9]。本研究将通过AMPK/mTOR通路初步探讨左、右归丸对PMOP模型大鼠股骨脂向分化的调节机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：60只SD雌性未生育大鼠[许可证号：SCXK(京)2014-0010]，SPF级，2月龄，体重200～220 g，购于辽宁长生生物技术有限公司，并于辽宁中医药大学动物实验中心饲养。

1.1.2试剂与仪器:SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒(WLA013)、AMPKα抗体(WL02254)、mTOR抗体(WL02477)、p-mTOR抗体(WL03694)、PPARγ抗体(WL01800)、C/EBPα抗体(WL02959)、C/EBPβ抗体(WL0 056 A)、内参β-actin(WL01845)均由wanleibio提供；p-AMPKα抗体(ab133448，abcam)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time,RR036 A，Takara)；SYBR Premix Ex TaqTMII(RR820，Tli RNaseH Plus)；酶标仪(BIOTEK)； Trizol(135306，Ambion),荧光定量PCR仪(CG-05，Heal Force)；Micro 17R微量台式离心机(美国Thermo公司)；电泳仪(DYY-7C)与转移槽(DYCZ-40D)均由北京六一公司提供；数字化全身骨密度仪(STRATOS DR,法国，Diagnostic Medical System SA)。

1.2 方法

1.2.1造模及分组：大鼠适应性喂养1周，随机分为空白组(KB)、假手术组(SHAM)、模型组(OVX)、左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、补佳乐组(Estradiol Valerate,BJL)，共6组。除KB组外，其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)进行麻醉，SHAM组大鼠摘除双侧卵巢周围等量脂肪，剩余大鼠从背部摘除双侧卵巢，建立PMOP模型大鼠，除造模、灌胃等原因导致大鼠死亡12只，取材时纳入大鼠48只，每组8只。……