钟顺平，杨贵伟，刘应华，杨贵树，高利波*

(1 云南农业大学动物医学院，云南 昆明 6502012；2 勐腊县勐仑镇农业综合服务中心，云南 西双版纳 666303)

猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)属于疱疹病毒科-疱疹病毒属成员，是一种有囊膜的线状双链DNA病毒，也是疱疹病毒科中抵抗力较强的一种。由PRV引起的猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是多种哺乳动物共患的一种急性传染病[1]。除了猪以外，其他动物感染伪狂犬病病毒后，主要表现为发热、奇痒及脑脊髓炎，死亡率极高。猪是伪狂犬病病毒的贮存宿主，发病后临床症状因感染猪年龄不同而有差异。妊娠母猪会出现流产、产死胎及木乃伊胎等综合症候群；初生仔猪会出现神经症状，如运动失调和麻痹等，最终衰竭而亡；成年猪多呈隐性感染，但可以引起呼吸道症状[2]。

随着养猪业的不断发展，云南省的猪病也越加复杂，为更好地了解和监控云南省勐腊县PRV野毒株的感染流行情况，本研究利用PCR对2019年该地区送检的血液样品进行了相应的病原检测，为后续有效控制和净化PR及进一步研究提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

2019年云南省勐腊县各个地区猪场送检的811份血液样品，包括5个规模化猪场的725份样品和散户的86份样品。

1.1.2 主要仪器

移液器(DRAGON公司，KA0052521)、超净工作台(苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1FD)、高速冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公 司，75005440)、凝胶成像系统(天能科技有限公司，Tanon-1600)、电泳仪(北京六一仪器厂，DYY-7C)、普通PCR仪(BIO-RAD公司，580BR 12007)和恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司，HWS12)。

1.1.3 主要试剂

DNA提取试剂盒(百泰克生物技术有限公司)，2×Transhifi Super Mix Ⅱ(含Tag DNA聚合酶，RNaase Inhibitor、dNTP和ddH2O，北京全式金公司)，DNA Marker DL1000(大连宝生物公司)，琼脂糖(GENE公司)；其他试剂由云南农业大学动物传染病实验室提供，试剂均为分析纯。

1.1.4 引物设计

根据NCBI GenBank中公布的PRV基因序列(FJ797217、KJ717942和AY169694)，设计一对特异性引物(表1)用于PCR检测。引物由昆明硕擎生物公司合成。

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1.2 方法

1.2.1 样品DNA提取

样品预处理和DNA提取均严格按照说明书进行，提取的DNA于－20 ℃下保存备用。

1.2.2 PCR扩增

将提取的DNA作为模板进行PCR扩增，反应体系为：2×Transhifi Super MixⅡ12.5 μL、ddH2O 10.5 μL、 上 游 引 物0.5 μL、下游引物0.5 μL和DNA 1.0 μL，总的反应体系为25 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环。取10 μL PCR扩增产物配制成体系后加样到1.5%琼脂糖凝胶孔中，120 V电压下电泳30 min，在凝胶成像系统上观察结果，并拍照。

2 结果与分析

2.1 PRV基因的PCR扩增结果

PRV基因的扩增结果同预期目的片段501 bp大小相符(图1)，表明部分样品呈PRV阳性。在811份血液样品中，337份样品检测为PRV阳性，阳性率为41.55%(337/811)。

2.2 不同猪场PRV的阳性率

在规模化猪场的725份血液样品中，334份呈PRV阳性，阳性率为46.1%(334/725)，各猪场间的阳性率差别较大，从35.4%～63.8%不等。散养户猪群的PRV阳性率为3.5%(3/86)。见表2。

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2.3 不同生长阶段猪群PRV的阳性率

不同生长阶段猪群(哺乳仔猪、保育猪和育肥猪)的血液样品共759份，采集自哺乳仔猪、保育猪和育肥猪的血液样品分别为290份、193份和776份，阳性率分别为57.9 %(168/290)、38.3% (74/193)和 28.6%(79/276)。各生长阶段猪群的阳性率差异较大，介于28.6%～57.9%，见表3。

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2.4 不同性别猪群PRV的阳性率

公猪和母猪的血液样品分别为10份和42份，阳性率分别为20%(2/10)和33.3%(14/42)，表明种公猪和母猪均有感染，见表4。

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3 讨论

我国自1948年首次报道PR以来，已有多个地区报道了该病的流行，给无数猪场带来了很大的经济损失。吴美芹等在对2010－2017年21个省市的猪血清样品进行猪伪狂犬病病毒野毒株gE抗体检测后，发现阳性率在7.90%～45.4%[3]。中国动物疫病预防控制中心从2011－2016年的检测数据发现gE的阳性率在13.0%～64.3%[4]。中科基因公司2017年的PRV gE抗体检测结果显示猪场的阳性率为77.0%，个体平均阳性率为43.3%[5]。

本文用PCR共检测了云南省勐腊县5个规模化猪场的725份猪血液样品和散养户的86份猪血液样品，发现PRV野毒株平均阳性率为41.6%，说明PR在云南省勐腊县的猪场中已有一定程度的流行。各猪场的PRV阳性率差别较大，猪场E的阳性率最低，为35.4%，猪场B的阳性率达63.8%，这可能与送检血液样品及各猪场的饲养管理和免疫程序等具体情况不同有关。据我们后续的调查发现，猪场B没有接种过猪伪狂犬病疫苗，这应该是该猪场阳性率比其他猪场高很多的缘故。除猪场E外，4个接种过猪伪狂犬病疫苗的规模化猪场PRV阳性率平均为48.8%。结合之前的报道，发现阳性率有上升趋势，郑旺华等报道云南省西双版纳州两个规模化猪场PRV抗原阳性率仅为11.9%[6]。这可能与2011年以来我国猪群中相继出现了致病性更强的猪伪狂犬病病毒变异毒株有关，变异毒株的抗原性发生变化使现有的gE基因缺失疫苗提供的保护作用不能发挥应有的保护作用。

本次检测散养户猪群PRV的阳性率仅为3.5%，远远低于规模化猪场的阳性率(46.1%)。本次采样的散养户猪群均未接种过猪伪狂犬病疫苗，和之前的一些报道相比[7]，勐腊县的散养户猪群PRV阳性率较低，这可能是因为与其他地区相比，勐腊县散养户的规模较小，养殖密度较低。从生长阶段看，勐腊县不同生长阶段猪群都感染了PRV，但感染率不同，感染率由高到低依次为哺乳仔猪、保育猪、母猪、育肥猪和公猪，与国内一些调查结果基本一致[5,8-9]。哺乳仔猪感染率高的原因主要是一些猪场忽视了对哺乳仔猪的免疫,随着母源抗体的消失，哺乳仔猪及保育猪的易感性增加。

从不同性别猪群看，母猪的阳性率为33.3%，高于公猪的阳性率(20%)，这在一定程度上说明了这一时期不同性别的猪对PRV的易感性存在差异。黄晓慧等应用ELISA对安徽地区不同规模化猪场2012－2015年采集的猪血清样品进行猪伪狂犬病病毒野毒株抗体检测，结果显示母猪的阳性率为27.46%，公猪的阳性率为22.22%[8]。总之，勐腊县猪群存在携带PRV的情况，且阳性率相对较高，在当前猪病防控的严峻形势下，有必要加强对种猪群的疫病检测，推行种猪场主要疫病的控制与净化工作势在必行。