张 伟，陈笑迎，吴金灿，贾晓钰，王 鑫

（1.河北农业大学理工学院，河北 沧州 061100；2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300450）

黄曲霉毒素(AFT)是一类化学结构类似的化合物，主要分子型包含B1，B2，M1，M2，G1，G2 等，是已知化学物质中致癌、致畸、致突变最强的一类物质[1-2]。黄曲霉毒素B1(AFB1)以毒性和致癌性最强作为黄曲霉毒素的代表物，污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麦、花生油等粮油及其食品，且以南方高温、高湿地区受污染最为严重[3-4]。黄曲霉毒素B1 的急性毒性是氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍，慢性毒性可诱发癌变，致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900 倍[4]。

目前检测食品和饲料中AFB1 含量的方法可以概括为三类：生物鉴定法、仪器分析法和免疫层析法[5]。生物鉴定法是通过生物体实验来验证样品的毒性部位和毒性机理，为判断AFB1 是否存在提供佐证。但生物鉴定法的专一性不强，灵敏度较低，一般只能作为化学分析方法的证实试验。而且，此方法的费用较高，所需时间较长，也需要有特殊的操作技巧。仪器分析法多用薄层色谱法和高效液相色谱法来检测AFB1[4]，测定结果准确，所以应用也比较广泛，但缺点是所需的仪器设备多，操作繁琐，所需时间长[5]。免疫层析法是一种固相标记免疫测定技术，其中以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料（硝酸纤维素膜）为固定相，以测试液为流动相。原理是将标记抗体固定于硝酸纤维素（NC）膜上，检测时利用毛细管作用，样品沿膜向前移动，当移动至固定有标记抗体的区域时，样品中相应的抗原与该抗体发生特异性反应，在检测区域显示一定的颜色[6-8]，从而实现特异性的免疫诊断。免疫层析法独有的特点是单份测定、方便快捷、特异性强、灵敏度高、结果准确，不需要大型仪器设备、几分钟内就可以通过肉眼观察到实验结果，并且能够保存，因此也越来越受到相关领域的关注[9-11]。

利用免疫层析技术竞争法的原理，在现有胶体金检测卡的基础上[12]，用一种新的材料胶体碳代替胶体金，建立一种简便、快速、准确的免疫检测方法，研究影响其性能的各个条件，使胶体碳试纸条更灵敏，更具有实用价值和经济意义。

1 材料与方法

1.1 材料

纳米碳粉：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PVC 底板、结合垫、吸水纸、样品垫、硝酸纤维膜：上海金标生物科技有限公司；吐温-20：上海生工生物工程有限公司；黄曲霉毒素B1 牛血清白蛋白偶联物：南京都英生物技术有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：美国sigma 公司分装；羊抗鼠IgG、黄曲霉毒素B1 单克隆抗体：山东绿都生物科技有限公司。

1.2 设备及仪器

旋涡混合仪：上海一恒科学仪器有限公司；BIODOT 点膜喷金仪：上海西宝生物科技有限公司；电热鼓风干燥箱：上海实研电炉有限公司；冷冻离心机：美国Thermo Electron；H-600 透射电镜：日本日立公司；超声仪器：上海生析超声波仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1胶体碳的制备

利用粒径为20 nm、30 nm 和50 nm 的碳粉分别制备浓度为0.02 g/L、0.05 g/L、0.10 g/L、0.20 g/L的胶体碳。方法：称取相应质量的碳粉溶解于超纯水中，超声至碳粉完全溶解，液体均匀。

1.3.2抗体的标记

需要确定加入的K2CO3和AFB1 单克隆抗体的最佳量。

AFB1 单克隆抗体的最佳标记量：试验采用氯化钠沉淀法确定AFB1 单克隆抗体的最佳标记量：分别取已准备好0.5 μg/mL 的AFB1 单克隆抗体0 μL、0.5 μL、1.0 μL、1.5 μL、2.0 μL 加入1 mL 胶体碳溶液中，3 h 后各加入0.1 mL 浓度为100 mg/mL氯化钠溶液，混匀后静置24 h。胶体碳容易发生沉聚，能保持胶体碳不发生沉聚的最小AFB1 单克隆抗体为最佳标记量[13-14]。

K2CO3最佳加入量的确定：取5 支离心管分别加1 mL 胶体碳，用1% 的K2CO3溶液调节pH 值至7.0[15]，再分别加入0 μL、1 μL、2 μL、3 μL、4 μL K2CO3溶液，最后加入AFB1 单克隆抗体的最佳量，碳标抗体经浓缩在NC 膜上与抗原结合，通过胶体碳试纸条的出线情况来确定K2CO3的最佳用量。T线与C 线应都显色，T 线显色颜色比较深，C 线显色颜色比较浅。

1.3.3标记抗体的纯化

标记后的抗体以离心速度5 000 r/min，离心温度4 ℃，离心时间30 min，进行低温高速离心纯化。离心后将管底可以流动的黑色沉淀转移到另一个离心管中，再加入400～500 μL 的重悬工作液，充分混合，使胶体碳颗粒分布均匀，具体加入量视沉淀情况而定。其中重悬工作液为1%海藻糖（蛋白保护剂）、0.5%BSA（稳定剂）、0.1% 吐温-20（表面活性剂）的磷酸缓冲（PBS）溶液。

1.3.4结合垫的水化、封闭处理及喷碳

结合垫材料选用Ahlstrom8964 玻璃纤维膜，使用前要进行水化、封闭处理，其目的是减少标记后的抗体在结合垫上的残留。处理液为0.01 mol/L PBS缓冲液，内含1%BSA 和5%蔗糖。首先选择合适大小的结合垫条，然后放入结合垫处理液中充分浸湿，拿出，在37 ℃条件下的烘箱中干燥2 h，将重悬好的胶体碳用移液枪均匀地喷在处理好的结合垫上，使胶体碳能更好的吸附，再放入干燥箱中干燥约10 min 后拿出，观察试纸条的出线结果。

1.3.5检测线（T 线）抗原和质控线（C 线）羊抗鼠IgG最佳包被浓度的选择

T 线使用的抗原的黄曲霉毒素B1 牛血清白蛋白偶联物（AFB1-BSA），用碳酸盐缓冲（CBS）液将包被抗原稀释5 个梯度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 mg/mL；同样用CBS 缓冲液将羊抗鼠IgG 分别做1:2、1:5、1:10、1:20、1:40 倍稀释，用稀释好的抗原和二抗在NC 膜上划线，两线相距5 mm，37 ℃干燥30 min，然后与处理好的胶体碳结合垫等材料组装成试剂条，用PBS 溶液点样，观察显色程度，C 线颜色不宜太深，否则检测样品时显色不明显，需产生足够强的显色信号同时不宜过浅，T 线选择显色较深的浓度，最后选择显色情况最好的浓度作为最佳包被浓度。

1.3.6试纸条的使用方法及结果判定

用滴管吸取待测样品在试纸条的样品垫处点样，点样量为2～3 滴，5～10 min 后观察显色情况。若是阴性结果（见图1 中a），则在检测区有两条黑色条带，T、C 线都显色；若是阳性结果（见图1 中b），则在检测区域有一条黑色条带，T 线不显色，C 线显色；若点样后，C 线不显色，结果都视为无效（见图1中c）。

图1 反应结果显示与判断示意图

2 结果与分析

2.1 胶体碳粒径对试纸条的影响

通过观察胶体碳溶液的颜色和均匀度。良好的胶体碳溶液应该整体均匀，颜色为黑色或者较黑色稍浅，且在室温下放置几天后颜色、均匀度基本不变。若制备的胶体碳放置几天后底部出现沉淀，上层澄清或有漂浮物，表明制备的胶体碳不成功。由透射电镜图（图2）看出相同浓度的20、30、50 nm 的胶体碳粒径逐渐增大，粒径为50 nm 的胶体碳容易聚集在一起，所以在放置几天后易形成沉淀。而20、30 nm 的胶体碳相比较而言，30 nm 的分布更均匀，显示胶体碳颗粒的外部形态比较规则，大部分颗粒呈现均匀分散的圆形，有利于结合抗体的形成，同时有助于自身以及碳标抗体的稳定。

图2 不同粒径胶体碳的透射电镜图

2.2 AFB1 单克隆抗体最佳标记量的确定

根据氯化钠沉淀法，加入1.00 μL、0.50 μg/mL的AFB1 单克隆抗体时胶体碳溶液没有发生聚沉，而加入0 和0.50 μL 蛋白的胶体碳底部都产生了沉淀。在1.00 μL 的基础上再加10%，即1.10 μL 为最佳蛋白标记量。

2.3 K2CO3 最佳加入量的确定

胶体碳在加入相同浓度不同量的K2CO3溶液后，基本无变化。而碳标抗体经浓缩在NC 膜上与抗原结合后，结果显示加入1.0 μL K2CO3制成的AFB1 胶体碳试纸条显色最好（见图3）。

图3 碳酸钾最佳加入量的确定

2.4 T 线抗原和C 线羊抗鼠IgG 最佳包被浓度的选择

通过将稀释好的抗原和二抗与其它材料制成的试纸条的显色情况（见图4），可以看出，C 线显色情况最好的是3 号试纸条，即最佳二抗稀释倍数为1:10。对于T 线，1、2、3 号显色情况相差不多，相比之下，3 号检测线略微深一些，所以最佳抗原浓度为0.20 mg/mL。

图4 T 线抗原和C 线二抗最佳包被量的确定

3 试纸条的性能测试

3.1 性能测试实验

3.1.1灵敏度试验

采用梯度稀释的方法来检测灵敏度，用含AFB1 的竞争品质量浓度为1 ng/mL、2 ng/mL、3 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL 的阴性PBS 点样于同一批试纸条，观察显色结果。

如图5 所示，ABF1 浓度2 ng/mL 时，T 线条带颜色很浅但没有完全消失，而ABF1 浓度为3 ng/mL时，肉眼观察T 线不显色C 线显色，所以该试纸条的检测限为3 ng/mL。为证明结果准确性，另外再做两批次试纸条和同样的梯度稀释，得到的结果相同。

图5 试纸条灵敏度测试结果

3.1.2特异性试验

试纸条的特异性通过检测AFB1 的结构类似物AFB2、AFG1、AFG2、AFM1 及赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮、伏马菌素来确定，检测3 次不同批次的试纸条。反应结果如图6 所示，与对照试纸条比较，可以发现试纸条检测AFG1、AFG2 的结果为阳性，而检测其它毒素结果都为阴性。所以结果说明该试纸条对黄曲霉毒素有良好的特异性[12]。

图6 试纸条特异性测试结果

3.1.3重复性试验

随机抽取20 条试纸条做阴性实验，结果显示C线均显示出黑色且颜色深度几乎无差别；但是有2条试纸条的T 线黑色较浅，其余18 条试纸条T 线显示出深黑色。再随机抽取20 条试纸条做阳性实验，结果显示T 线均不显现；C 线均显现黑色且颜色深度基本一致。由此可以判断试纸条的重复性为98%。

3.1.4稳定性试验

将试纸条分别放在4 ℃、室温37 ℃的条件下保存，一段时间后做阳性检测和阴性检测。为保证结果的准确性，所以要检测3 批试纸条。从阳性检测和阴性检测的结果来看，4 ℃、室温条件下保存一个月，37 ℃条件下保存7 天，试纸条均有效，但在37 ℃下保存长时间的试纸条条带颜色变浅。通常试纸条在37 ℃下保存1 d 相当于4 ℃下保存1.5 个月[13]。据此推算该试纸条在4 ℃下保存期至少为10 个月。

3.2 样本添加试验

对花生油进行AFB1 添加实验，添加浓度为0 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、3 ng/mL、5 ng/mL，添 加AFB1 后的样品分别用竞争ELISA 法和胶体碳试纸条进行检测。比较两种方法的检测结果发现，ELISA法中除空白对照组为阴性外，添加组都为阳性。而使用试纸条检测时，添加浓度低于2 ng/mL 时为阴性；但添加量为2 ng/mL 时，T 线黑色较浅；当添加的浓度≥3 ng/mL 时，结果为阳性，试纸条的检测限虽不及ELISA，但足以检测AFB1 是否超标。

4 结论

使用现有的不同粒径的纳米碳粉制成不同浓度的胶体碳溶液，胶体碳标记AFB1 单克隆抗体经纯化后吸附于玻璃纤维素膜上，将T 线和C 线在NC膜上划好，干燥后与处理好的样品垫、有碳标抗体的结合垫、吸水纸组装成试纸条。

在进行试纸条的工艺优化时，发现胶体碳的最佳粒径为30 nm、最适浓度为0.20 g/L，0.1 mol/L 的碳酸钾溶液最佳用量为1.00 μL，浓度0.50 μg/mL的AFB1 单克隆抗体的最佳标记量为1.10 μL，检测线包被抗原最佳浓度0.20 mg/mL，质控线羊抗鼠IgG 稀释倍数为1:10，比较适合用于AFB1 胶体碳试纸条的制备。

通过检测AFB1 胶体碳免疫层析试纸条的各种性能，结果表明该试纸条的灵敏度为3 ng/mL，该试纸条对黄曲霉毒素有较好的特异性；在重复性试验中，重复性高达98%且没有出现假阴性的情况，在4℃条件下可保存至少10 个月。通过AFB1 胶体碳试纸条和ELISA 两种方法对样品进行加标试验可以发现，胶体碳试纸条的灵敏度不及ELISA，所以这也是免疫层析技术所要突破的问题。

本课题研究了AFB1 胶体碳试纸条的研制方法，包括试纸条的原料选择、试纸条的组装、条件优化、性能测试等一系列步骤。得到一条比较合适AFB1 胶体碳试纸条的制备途径。并且制得的AFB1胶体碳试纸条可以快速准确的判断出食品中的AFB1 是否符合标准规定，具有很高的应用价值。