郝阳光， 陈薇， 章雪婷， 胡卜什

（1. 沈阳医学院转化医学研究中心， 辽宁 沈阳110034； 2. 公共卫生学院卫生检验与检疫专业2017 级； 3. 基础医学院临床医学专业2018级）

研究发现许多控制造血作用的信号通路在哺乳动物与果蝇之间是高度保守的， 如调控哺乳动物骨髓造血作用的Dpp／BMP、 Wnt、 JAK－STAT 及胰岛素信号通路也影响果蝇淋巴腺造血干细胞的再生及分化， 因此果蝇造血系统已逐渐成为研究血细胞发育的遗传模型［1］。 淋巴腺是果蝇幼虫时期重要的造血器官， 由三个区域构成： 成熟的浆细胞及晶细胞位于CZ 区（cortical zone）， 干细胞样的前体血细胞位于MZ 区（medullary zone）， 而PSC 区（posterior signaling center） 作为造血干细胞小生境能够维持MZ 区前体血细胞的正常分化［2－4］。

jumu基因是果蝇Fox 转录因子家族成员， 我们前期研究发现该基因通过调控淋巴腺MZ 区Col的表达来维持前体血细胞的分化， 同时通过调控PSC 区dMyc的转录控制PSC 细胞的增殖［5］；jumu基因缺失可导致游离血细胞的增殖［6］。 此外， 近期研究表明jumu基因通过调控细胞的增殖及凋亡影响果蝇翅原基的发育［7］。 本研究探讨了jumu基因缺失对果蝇淋巴腺血细胞增殖及凋亡的影响，为深入理解该基因在果蝇淋巴腺中的作用及调控机制提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 野生型果蝇w1118（为本实验对照组）、jumu缺失突变体jumuGE27806及jumuDf2.12、 淋巴腺MZ 区特异性表达Gal4 品系domeless－Gal4UAS－2xEGFP均为东北林业大学金丽华教授惠赠； rabbit anti－PH3 antibody （德国Millipore 公司）； rabbit anti－GFP antibody、 Alexa Fluor 488 标记的鬼笔环肽（phalloidin）、 4′， 6－二脒基－2－苯基吲哚（DAPI）、 7－氨基放线菌素D （7－AAD）、 Alexa Fluor 488 荧光二抗（美国Thermo Fisher Scientifific公司）； mouse anti－BrdU antibody （美国Developmental Studies Hybridoma Bank 公司）； In Situ Cell Death Detection Kit （美国Roche Biochemicals 公司）； 果蝇培养基由本实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 PH3 及GFP 免疫荧光染色 提取果蝇三龄幼虫淋巴腺或血细胞置于载玻片上， 血细胞需静止30 min， 3.7%甲醛固定15 min， 5%羊血清封闭30 min， 加入PH3 抗体或GFP 抗体（1 ∶100） 并置于4 ℃冰箱孵育过夜， 加入Alexa Fluor 488 荧光二抗（1 ∶200） 结合2 h， DAPI （1 ∶500） 结合10 min， 封片剂封片并在荧光显微镜下观察。

1.2.2 BrdU 标记 提取果蝇三龄幼虫淋巴腺并置于含有160 μg／ml BrdU 的Schneider 昆虫细胞培养基中孵育1 h， 3.7%甲醛固定30 min， 酸解（3 mol／L HCl） 30 min 后结合BrdU 抗体， 后面方法同1.2.1。

1.2.3 phalloidin 染色 将提取的淋巴腺置于3.7%甲醛固定10 min， 0.1% TritonX－100 透化5 min， Alexa Fluor 488 标 记 的phalloidin 结 合30 min， 封片油封片并置于显微镜下观察。

1.2.4 TUNEL 及7－AAD 染色 TUNEL 染色参考In Situ Cell Death Detection Kit （Roche）， 淋巴腺先用3.7%甲醛固定30 min， 100 mmol／L 枸橼酸钠（sodium citrate） ＋0.1%PBT （PBS＋0.1% TritonX－100） 冰上孵育3 min， TUNEL 混合液37 ℃孵育75 min。 7－AAD 染色： 提取的淋巴腺直接置于7－AAD （5 μg／ml） 中染色30 min， DAPI （1 ∶500） 结合10 min。

1.2.5 图像分析及定量 所有定量图像均用荧光显微镜进行采集， 并用ImageJ 软件进行分析， 每组采集的淋巴腺均不少于20 个， 细胞数不少于500 个， 并均进行3 次以上生物学重复。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 6 软件进行统计学分析， 组间差异采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1jumu基因缺失对果蝇淋巴腺增殖的影响 通过PH3 抗体染色检测淋巴腺处于有丝分裂M 期的血细胞， 该结果显示， 与野生型对照组w1118相比，jumu基因缺失杂合子jumuGE27806／＋与jumuDf2.12／＋及jumu双突变体jumuGE27806／jumuDf2.12淋巴腺中PH3＋血细胞数量明显增加， 见图1A－E； 通过BrdU 抗体染色检测淋巴腺处于有丝分裂S 期的细胞， 结果显示， 与对照组相比，jumu基因缺失杂合子淋巴腺中BrdU＋血细胞数量没有明显增加， 但jumu双突变体的BrdU＋血细胞数量显著增加， 见图1F－I。

图1 jumu 基因缺失对果蝇淋巴腺血细胞增殖的影响

2.2jumu基因缺失对淋巴腺血细胞发育及细胞黏附性的影响 phalloidin 用于标记淋巴腺的F－actin细胞骨架， 结果显示， 与对照组w1118淋巴腺血细胞相比，jumu基因缺失突变体淋巴腺血细胞明显增大，jumu基因双突变体jumuGE27806／jumuDf2.12淋巴腺中部分血细胞的直径约为对照组的2 倍， 且细胞排列不规则， 细胞间连接不紧密且淋巴腺边缘出现不规则缺口， 见图2A－C。dome＞GFP主要表达在淋巴腺MZ 区， 标记前体血细胞， 但在游离血细胞中不表达。 通过检测游离血细胞中dome＞GFP＋阳性细胞的数量来判断淋巴腺解离情况， 结果显示， 与对照组相比，jumuDf2.12／＋游离血细胞中dome＞GFP＋阳性的前体血细胞占总细胞数的22%，约为对照组的5 倍， 见图2D－F。

图2 jumu 基因缺失对淋巴腺血细胞发育及细胞黏附性的影响

2.3jumu基因缺失对淋巴腺血细胞凋亡的影响采用TUNEL 染色方法分析淋巴腺血细胞凋亡， 结果显示， 与对照组相比，jumu基因缺失突变体淋巴腺血细胞并未出现明显凋亡； 7－AAD 染色用于标记死亡的细胞， 结果显示， 与对照组相比，jumu基因缺失突变体淋巴腺中死亡的血细胞数量并未明显增加， 见图3。

图3 jumu 基因缺失对淋巴腺血细胞凋亡的影响

3 讨论

造血作用是一个比较复杂的生物学过程， 包括造血干细胞的静息及分化， 该稳态遭到破坏会导致血液肿瘤的发生， 如白血病等。 淋巴腺作为果蝇重要的造血器官［8］， 已逐渐用于造血干细胞维持及分化机制的研究。 近来研究表明， 一些引起白血病发生的信号通路， 如JAK－STAT 的激活可诱导果蝇出现类似白血病的表型， 如淋巴腺的过度增长及血细胞数量的增加及黑色素瘤的产生等［9］。 可引起慢性粒细胞白血病（CML）、 急性髓细胞或淋巴性白血 （AML／ALL） 的BCR－ABL、Tax－1、 RUNX1 及NUP98－HOXA9 （NA9） 融合蛋白也能导致果蝇淋巴腺出现类似白血病的性状［1，10］。

我们前期研究发现Jumu 分别在淋巴腺的MZ及PSC 区调控前体血细胞的分化， 同时发现jumu基因严重缺失可导致淋巴腺lobe2 异常增大， 但并未进一步分析Jumu 对整个淋巴腺增殖的影响。 本研究发现Jumu 通过调控有丝分裂细胞周期来维持淋巴腺血细胞的正常增殖，jumu基因的缺失可加速细胞周期进程， M 期及S 期的血细胞数明显增加最终导致淋巴腺的增殖。 此前的研究中发现jumu基因的严重缺失仅导致淋巴腺lobe2 的增大，但部分lobe1 要比对照组要小。 本研究发现jumu基因的缺失可导致淋巴腺血细胞的过早解离， 可能是导致淋巴腺lobe1 变小的主要原因。 正常情况下淋巴腺只有到了成蛹阶段才开始发生解离并释放血细胞到血淋巴中［11］。 此外， 当宿主受到感染时也会引起淋巴腺血细胞的增殖、 薄层血细胞分化及血细胞的释放［8，12］。 前期的研究结果表明jumu基因的缺失引起淋巴腺免疫信号的激活及薄层血细胞的产生［5］， 因此淋巴腺的过早解离可能是免疫信号激活导致的。 此外之前的研究结果发现jumu基因的缺失导致游离血细胞actin 细胞骨架的改变， 出现伪足缺失的表型［6］， 因此淋巴腺血细胞的过早解离也可能是由于细胞骨架的改变导致细胞间黏附性减弱而引起的。 同时本研究发现， 与游离血细胞表型一致，jumu基因缺失突变体淋巴腺血细胞明显增大。 尽管有研究表明jumu基因的缺失可引起翅原基凋亡及死亡细胞增加［7］， 但本研究结果并未发现淋巴腺血细胞的凋亡， 表明Jumu 通过不同的调控机制参与不同的组织器官的发育。

综述所述， Jumu 通过调控细胞周期影响淋巴腺血细胞的增殖， 但其具体调节机制还有待进一步的研究。