陈秋仪 任培中 王佳美 弓雪峰 李芷悦 崔红生

摘要 目的：观察加减乌梅丸颗粒对哮喘大鼠激素干预模型气道重塑及转化生长因子（TGF）-β₁/Smad信号通路的影响。方法：选取30只雄性SD大鼠并随机分为正常组、哮喘组、地塞米松组、布地奈德组及中药组，除正常组外其余组以卵蛋白致敏、雾化激发方法建立哮喘大鼠模型，除正常组和哮喘组外其余均予地塞米松干预并逐步撤减，布地奈德组予以普米克令舒雾化，中药组予以加减乌梅丸颗粒灌胃。光镜下观察各组大鼠肺组织病理形态学改变，测定气道壁面积百分比（Wat%）、气道平滑肌面积百分比（Wam%），免疫组织化学法比较各组Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）表达水平，蛋白质印迹法和荧光定量PCR法比较TGF-β₁、Smad2、Smad3、Smad7蛋白及基因表达水平。结果：与正常组比较，哮喘组大鼠气道壁及平滑肌层明显增厚，管腔变窄，Wat%、Wam%升高，差异有统计学意义（P<0.05），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β₁、Smad2、Smad3蛋白及基因表达水平均升高，差异有统计学意义（P<0.05），Smad7表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与哮喘组比较，地塞米松组Wat%降低，差异有统计学意义（P<0.05），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），TGF-β1、Smad3蛋白及基因表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与地塞米松组比较，中药组Wat%降低，差异有统计学意义（P<0.05），Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），TGF-β₁、Smad2、Smad3蛋白及基因表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：加减乌梅丸颗粒可通过调控TGF-β1/Smad信號通路从而减少气道平滑肌增生以及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白沉积，抑制气道壁增厚，延缓气道重塑的发展。

关键词  加减乌梅丸颗粒;哮喘大鼠;激素干预;气道重塑;转化生长因子-β₁/Smad信号通路

Effect of ModifiedModified Wumei Pill Granule on Airway Remodeling and TGF-β1/Smad Signal Pathway in Asthma Rat Model with Glucocorticoids Intervention

CHEN Qiuyi，REN Peizhong，WANG Jiamei，GONG Xuefeng，LI Zhiyue，CUI Hongsheng

（Department of Respiratory Medicine，Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To observe the effect of Modified Wumei Pill Granule on airway remodeling and TGF-β1/Smad signal pathway in asthma rat model with glucocorticoids intervention.Methods：Totally 30 SD mal rats were randomly divided into the normal group，the asthma group，the dexamethasone group，the budesonide group and the Chinese medicine group.Except for rats in normal group，rat in the other groups were sensitization and stimulation with ovalbumin（OVA）to establish the asthma model.Except for rats in normal and asthma groups，rats in the other groups were treated with dexamethasone and gradually withdrawn.Rats in the budesonide group were inhaled with budesonide.Rats in the Chinese medicine group were poured Modified Wumei Ppill Granule into stomach.Observe the lung histopathological changes under light microscope.Measured the percentage of total wall area（Wat%）and airway smooth muscle area（Wam%）.The expression levels of Collagen I and Collagen III in each group were compared by immunohistochemical method.The expression levels of TGF-β1，Smad2，Smad3，Smad7 protein and gene were compared by Western Blotting and RT-PCR.Results：1）Compared with the normal group，the airway wall and smooth muscle layer of asthmatic rats were significantly thicker，the lumen became narrower，Wat% and Wam% increased（P<0.05），and the expression levels of Collagen I，Collagen III，TGF-β₁，Smad2，Smad3 protein and gene increased（P<0.05），while the expression level of Smad7 decreased（P<0.05）.2）Compared with asthma group，Wat% decreased in dexamethasone group（P<0.05），Collagen I and Collagen III decreased（P<0.05），and TGF-β1，Smad3 protein and gene expression decreased（P<0.05）.3）Compared with dexamethasone group，Wat% decreased（P<0.05），Collagen I and Collagen III decreased（P<0.05），and TGF-beta 1，Smad2，Smad3 protein and gene expression decreased（P<0.05）.Conclusion：By regulating TGF-β₁/Smad signal pathway，Modified Wumei pill granule can reduce the proliferation of airway smooth muscle and the deposition of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ protein，inhibit the thickening of airway wall and delay the development of airway remodeling.

Keywords Modified Wumei Pill Granule; Asthmatic rat; Glucocorticoids intervention; Airway remodeling; TGF-β₁/Smad signal pathway

中图分类号：R289.5;R256.12 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.005

支气管哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的气道慢性炎性疾病，临床以吸入性糖皮质激素（Inhaled Corticosteroid，ICS）为治疗首选药物[1]。然而存在部分哮喘患者对激素治疗不敏感，需长期大剂量使用ICS或全身性糖皮质激素来控制症状，通常将此类哮喘称为激素依赖性哮喘（Steroid-dependent Asthma，SDA）[2]。气道重塑是SDA发生发展的重要因素，可引起气道弹性下降，气流受限持续甚至不可逆，加重哮喘症状。目前转化生长因子（TGF）-β₁/Smad信号通路被认为是气道重塑的重要调控途径，TGF-β₁可引起气道平滑肌增殖、促使气道胶原和蛋白沉积[3]，调节该通路平衡有望成为预防或减轻哮喘气道重塑的新靶点。本课题组近年来运用经典名方乌梅丸加减治疗SDA临床疗效显著，为进一步研究其作用机制和作用靶点，本实验建立哮喘大鼠激素干预模型，观察加减乌梅丸颗粒对模型大鼠肺组织病理改变以及TGF-β₁/Smad信号通路的影响，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取SPF级健康雄性SD大鼠30只，体质量120～140 g，鼠龄4～5周，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司，饲养于北京中医药大学基础医学院动物房，适应性喂养1周。

1.1.2 药物 加减乌梅丸颗粒（药物组成：乌梅]10 g、制附片10 g、党参10 g、当归10 g、桂枝6 g、白芍10 g、细辛3 g、黄芩10 g、黄柏6 g、椒目10 g、苏子10 g;由北京康仁堂药业有限公司提供并制备为颗粒剂，约9 g/袋）。普米克令舒（吸入用布地奈德混悬液，澳大利亚AstraZeneca Pty Ltd公司，货号：823740）。地塞米松磷酸钠注射液（国药集团容生制药有限公司，货号：H41020059）。卵蛋白（Ovalbumin，OVA，美国Sigma公司，货号：A6349）。

1.1.3 试剂与仪器 Anti-Smad2抗体（美国Abcam公司，货号：ab63576）;Anti-Smad3抗体（美国Abcam公司，货号：ab40854）;Anti-Smad7抗体（美国Proteintech公司，货号：25840-1-AP）;Anti-TGF beta 1抗体（美国Abcam公司，货号：ab92486）;Anti-Collagen Ⅰ抗体（美国Abcam公司，货号：ab34710）;Anti-Collagen Ⅲ抗体（美国Abcam公司，货号：ab6310）;即用型免疫组织化学法试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司，货号：KIT-9706）;DAB显色试剂盒（福建迈新生物技术开发有限公司，货号：DAB031）;ECL超敏发光液（北京博奥森生物技术有限公司，货号：pe0010）;TRIZOL（美国Invitrogen公司，货号：15596026）;引物由上海生工生物工程有限公司合成。压缩式雾化器（欧姆龙有限公司，NE-C900型）;自动化智能型正置研究级显微镜（日本Olympus公司，BX53型）;荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司，CFX96型）;凝膠成像分析系统（美国ALPHA公司，FLUORCHEM 5500型）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 采用随机数字表法，将大鼠分为正常组、哮喘组、地塞米松组、布地奈德组及中药组，每组6只。根据参考文献[4]复制哮喘大鼠气道重塑激素干预模型，地塞米松组大鼠于实验第l天和第8天腹腔注射卵白蛋白（OVA，100 mg）与氢氧化铝凝胶（100 mg）混合液致敏，第15天开始以1%OVA进行雾化激发，30 min/次，隔天1次，共7周。在每次激发前30 min给予地塞米松0.5 mg/kg腹腔注射，连用2周。从第3周开始，按每周]0.1 mg/kg速度递减地塞米松用量，至第7周地塞米松全部]撤除。

1.2.2 给药方法 布地奈德组大鼠在地塞米松组的基础上，从实验第15天开始每天给予0.5 mg/mL的普米克令舒雾化吸入，30 min/次，连续7周，第63天结束。激发日则于激发前1 h吸入。中药组大鼠在地塞米松组的基础上，从实验第15天开始每天给予加减乌梅丸颗粒1.88 g/kg灌胃，1次/d，连续]7周，第63天结束。激发日则于激发前2 h灌胃。哮喘组致敏与激发流程同地塞米松组，腹腔注射以生理盐水代替地塞米松。正常组大鼠致敏、激发、腹腔注射均使用等量生理盐水。除中药组外，其余组大鼠均以等量生理盐水灌胃。

1.2.3 检测指标与方法 于末次给药24 h后取材，每组大鼠以3.5%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，取仰卧位固定于手术台上，打开腹腔，腹主动脉放血法处死大鼠，开胸。摘取左肺置于多聚甲醛中固定，用于病理形态学观察及免疫组织化学法检测;右肺上叶、中叶分别置于冻存管内-80 ℃冰箱保存，用于蛋白质印迹法和PCR检测。

1）病理形态学观察：将在多聚甲醛中固定24 h后的左肺组织依次进行乙醇脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片，行Masson染色，在光镜下观察，选取同一层级支气管采集图像，比较各组病理形态学改变。应用Image-pro Plus 6.0医学图像分析软件测定支气管外缘内面积（Area enclosed by Outer Perimeter，Ao）、气道壁面积（Total WallArea，Wat）、气道平滑肌面积（Airway Smooth Muscle Area，Wam），计算气道壁面积百分比（Wat%=Wat/Ao）、气道平滑肌面积百分比（Wam%=Wam/Ao）作为气道重塑的观察指标。

2）免疫组织化学检测：取未染色的切片进行脱蜡、脱水、修复，分别用需检测蛋白的一抗和相应的二抗进行孵育，用DAB显色、苏木精复染后，常规脱水、中性树脂封片并在光镜下观察，选取同一层级支气管采集图像，应用Image-pro Plus 6.0医学图像分析软件测定各组大鼠肺组织内Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）的平均吸光度值（MOD）。

3）蛋白质印迹法检测：取出冻存的肺组织，用BCA法测定目的蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），置于5%的脱脂奶粉封闭液中室温封闭1 h，加入需检测蛋白的一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入相应的二抗，室温摇床孵育1 h，取出PVDF膜用ECL超敏发光液曝光。采用Quantity One软件分析图像，以目的蛋白与β-actin的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。

4）RT-PCR检测：按照试剂盒说明，以Trizol法提取大鼠肺组织总RNA，并测定RNA浓度及纯度。根据浓度取1 μg总RNA，按照反转录试剂盒操作说明将RNA反转录为cDNA。取cDNA产物2 μL，分别加入2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，]10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，去离子水7.2 μL，以20 μL反应体系进行PCR扩增。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环，获得各样本待测基因的CT值。采用2-△△CT法计算基因相对表达量，进行统计分析（-△△CT为目标基因CT值与内参基因CT值的差值，△△CT为实验组△CT值与对照组△CT值的差值，2-△△CT指实验组相对于对照组的基因表达倍数）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析或非参数检验，组间两两比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理形态学观察

Masson染色结果显示，与正常组比较，哮喘组大鼠气道管腔明显变窄，气道壁、平滑肌层和基底膜层厚度显著增加;与哮喘组比较，地塞米松组、布地奈德组、中药组气道改变均有减轻，气道壁、平滑肌层和基底膜层厚度降低。见图1。

2.2 各组大鼠气道壁及平滑肌面积占支气管外缘内面积百分比比较

与正常组比较，哮喘组Wat%、

Wam%均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与哮喘组比较，地塞米松组、布地奈德组及中药组Wat%均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），中药组Wam%显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与地塞米松组比较，布地奈德组、中药组Wat%显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠肺组织内CollagenⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表达比较

与正常组比较，哮喘组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与哮喘组比较，地塞米松组、布地奈德组及中药组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与地塞米松组比较，布地奈德组、中药组Collagen Ⅲ蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），中药组Collagen Ⅰ蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。見表2，图2、3。

2.4 各组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表达比较

与正常组比较，哮喘组TGF-β1、Smad2、Smad3均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），Smad7显著降低，差异有统计学意义（]P<0.05）;与哮喘组比较，地塞米松组、布地奈德组及中药组TGF-β1、Smad3均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），中药组Smad2显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）、Smad7显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与地塞米松组比较，中药组TGF-β1、Smad2、Smad3显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，图4。

2.5 各组大鼠肺组织内TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA相对表达量比较

与正常组比较，哮喘组TGF-β1、Smad2、Smad3均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），Smad7显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与哮喘组比较，地塞米松组、布地奈德组及中药组TGF-β₁、Smad2、Smad3均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），Smad7显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与地塞米松组比较，布地奈德组及中药组TGF-β₁、Smad2、Smad3均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05），Smad7显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

SDA属于重症哮喘范畴，控制水平差，严重影响患者生命质量，加重社会经济负担[5]。该病发病机制与气道重塑、气道炎性异质性、遗传易感性和糖皮质激素反应性降低等多方面因素相关[6]。研究发现，相对于轻中度哮喘患者，SDA患者存在更严重的气道重塑，网状层与基底膜厚度显著增加，尽管使用高剂量的糖皮质激素治疗，依然不能控制气道重塑的继续发展，反而产生严重的激素依赖[7]。气道重塑可使气道弹性下降，气流受限持续甚至不可逆，肺功能持续下降，气道高反应性持续，对激素治疗反应性差，症状更加严重，哮喘难以控制[8-9]。因此阻抑气道重塑的发生发展是SDA防治的核心]内容。

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