徐小博 徐萍 岳永德 汤锋 王进 荀航

(新乡学院，新乡，453000) (国际竹藤中心)

土壤因子和植物次生代谢产物存在密切关系，一方面，植物在生长过程中会对土壤微生物产生影响，例如植物通过植物地上部分的淋洗和挥发、根的分泌及植物残体的腐解等途径可以将体内的次生代谢产物释放到土壤中，对其它植物、土壤动物和微生物的生长发育造成[1-3]。另一方面，微生物可以促进植物生长，特别是有益菌，有利于植物营养吸收和植物代谢产物，保护植物抵抗各种土传病原菌，并能帮助植物适应许多环境压力，缓解非生物胁迫[4-5]。此外，植物土壤微生物也可通过降解土壤中的化感物质，干扰植物和化感成分之间的作用[6]。竹子是重要的森林资源，竹叶中的次生代谢产物与土壤微生物群落的关系，值得深入研究。关于竹叶次生代谢产物随时间变化已有相关报道，并对毛竹、小琴丝竹等竹种的竹叶中的酚类物质、黄酮、内酯等次生代谢产物变化进行了研究[7-10]，但缺少对具体次生代谢产物变化的研究。

高节竹(Phyllostachysprominens)为禾本科竹亚科刚竹属重要经济竹种，是一种集观赏、生态防护、笋用、材用于一体的多用竹种，分布广，经济价值高[11]。本研究以不同时期的高节竹竹林土壤为研究对象，测定高节竹叶次生代谢产物以及竹林土壤3大微生物群落的季节动态变化。分析高节竹叶次生代谢产物和土壤微生物群落季节变化特征，探讨次生代谢产物的变化与土壤微生物群落的相互联系，为高节竹竹林的可持续发展提供技术支持。

1 研究地概况

研究地位于浙江省杭州市富阳区永昌镇(119°25′～120°19.5′E、29°44～30°11′N)，该地属中亚热带季风气候，温暖湿润，四季分明。年平均气温16.1 ℃，7月平均气温28.1 ℃，1月平均气温3.8 ℃，极端高温41.3 ℃，极端低温-12.3 ℃，10 ℃积温5 100 ℃，多年平均无霜期232 d。年降水量1 426 mm，降水量随季节变化，7—8月为季节性干旱期。年平均蒸发量1 392 mm，年平均相对湿度79%，年日照时间为1 850～1 950 h。

2 材料与方法

2.1 试验材料

竹叶样本：在采样地选择一片长势良好的2年生高节竹竹林中，分别设置3个20 m×20 m的样方，每个样方中随机设置3个3 m×3 m的小样方。在每个小样方采集竹叶，采集植株上、中、下部的健康叶片，然后混匀，样品自然阴干至恒质量，粉碎后，放置在冰箱中4 ℃保存备用。竹叶采样时间在2018年1、3、5、7、9和11月份的中旬。

土壤样本：在实验区内分别选择100 m2的高节竹竹林地设置为固定样方。不同时期土壤特征样本，采样时间为2018年1、3、5、7、9和11月份的中旬；土壤微生物和土壤酶的样本，采样时间为9月15日左右。在每个样地内布设的5个土样采集点，每样点3个重复，采集0～20 cm深度的土壤样品，取样时去除土壤表层凋落物及其他杂物，并剔除土壤中植物根系和石块。每个样品采样量为1.0 kg左右，装入无菌袋放置带冰块的泡沫箱内，带回实验室，贮存于冰箱内4 ℃保存备用。

对照品(异荭草苷、荭草苷、对香豆酸、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁、木犀草苷、苜蓿素7-O-葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素(纯度>98%))购于上海源叶生物生物技术有限公司，色谱试剂购于美国Fisher公司。

2.2 竹叶次生代谢物的检测

高效液相色谱检测方法参考魏琦等[12]方法，准确称取竹叶粉2.0 g于50 mL离心管中，加入体积分数70%乙醇30 mL，超声提取30 min，过滤，重复提取3次，合并上清液，并浓缩。用50 mL水悬浮于分液漏斗中，加50 mL石油醚萃取，重复3次，将下层水溶液浓缩，用体积分数70%乙醇溶解于10 mL容量瓶中，定容至刻度，过0.45 μm微孔滤膜待测。每个样品做3次重复。高效液相色谱(HPLC)检测条件：色谱柱为Inertsil ODS-3 C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相为乙腈和体积分数0.5%磷酸水溶液，梯度洗脱，洗脱方法见表1；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为340 nm；进样量为10 μL。利用样品中对应的峰面积计算竹叶中被检测成分的质量分数。

表1 高效液相色谱方法中的梯度洗脱方法

2.3 土壤微生物数量测定

细菌数量测定参考许光辉等[13]和王理德等[14]的方法，将混合均匀的土样稀释至10-6，分别取0.1 mL浓度梯度为10-4、10-5、10-6土壤溶液涂布至细菌选择培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)，培养温度37 ℃，培养时间为1～2 d，以平板表面涂抹法计数。

真菌数量测定参考王理德等[14]的方法，分别取0.1 mL浓度梯度为10-2、10-3、10-4土壤溶液涂布至真菌选择培养基(马丁-孟加拉红培养基)，培养温度28 ℃，培养时间为2～3 d，以平板表面涂抹法计数。

放线菌数量测定参考王理德等[14]的方法，分别取0.1 mL浓度梯度为10-2、10-3、10-4土壤溶液涂布至放线菌选择培养基(改良高氏一号培养基)，培养温度28 ℃，培养时间为3～5 d，以平板表面涂抹法计数。

微生物数量用每克样品的菌落数(菌落·g-1)表示，每克样品的菌落数=同一个稀释度几次重复的菌落平均数×5×稀释倍数。

2.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010计算数据平均值、标准差等，并完成图表制作。采用SPSS 19.0软件进行Pearson法相关分析。

3 结果与分析

3.1 竹叶中10种次生代谢产物的检测结果

由图1可知，按照实验的高效液相色谱条件，50 min内对10种次生代谢产物实现良好分离。由表2可知，试验方法进一步通过回归方程、R2、最小检出量(LOD)及最低测定质量分数(LOQ)进行确证。10种次生代谢产物标准品在线性范围内呈良好的线性关系；10种次生代谢产物标准品的LOD值在0.01～0.03 mg·kg-1，LOQ值在0.02～0.34 mg·kg-1。

表2 10种次生代谢产物的质量浓度和峰面积的线性关系

3.2 高节竹竹叶次生代谢产物的时间变化

由表3、图2、图3可知，异荭草苷、荭草苷、对香豆酸、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁、木犀草苷和苜蓿素7-O-葡萄糖苷等8种次生代谢物的质量分数峰值出现在1月份或11月份。异荭草苷和对香豆酸的质量分数最高出现在1月份，质量分数分别为4.661 2、0.025 1 mg·g-1，与其他月份差异极显著；木犀草苷的质量分数在11月份最高，质量分数为0.359 1 mg·g-1，显著高于其他月份；苜蓿素7-O-葡萄糖质量分数的最高值出现在11月份，质量分数为0.698 0 mg·g-1。

表3 不同时间竹叶次生代谢产物质量分数的变化 mg·g-1

从1月份开始，异荭草苷、荭草苷、对香豆酸、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁和苜蓿素7-O-葡萄糖苷质量分数均降低，其中异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、芦丁的质量分数最低值出现的7月份。苜蓿素7-O-葡萄糖质量分数的最低值出现在5月份，质量分数为0.054 1 mg·g-1；对香豆酸的质量分数最低值出现在9月份，质量分数为0.007 9 mg·g-1。芹菜素在1年中质量分数变化趋势为先升高后降低。高节竹竹叶中仅在5月份检测到木犀草素，质量分数为0.007 9 mg·g-1。

从被检测的10种次生代谢的总量看，1月份质量分数最高(6.601 7 mg·g-1)，1—7月份，被检测物总量逐渐降低，7月最低(1.044 0 mg·g-1)，然后逐渐上升，11月份总量上升至5.624 3 mg·g-1。

3.3 高节竹竹林土壤微生物群落的时间变化

由表4可知，微生物3大类群随时间均具有明显动态变化。土壤中细菌为优势种群，细菌数量占微生物总数的98.88%～99.69%。3月份土壤放线菌数量高于土壤真菌数量，3月份土壤放线菌占总微生物数量比例为0.65%，而1、5、7、9、11月份的土壤真菌数量高于土壤放线菌数量。

表4 高节竹竹林土壤微生物数量的季节变化

一年中，不同时期高节竹竹林土壤细菌数量差异显著(P<0.05)，7月份土壤细菌数量最多，细菌数量为24.91×106菌落·g-1，分别是1、3、9月份土壤细菌的7.12、3.01、2.69倍，说明土壤微生物生长繁殖随季节变换而变化，夏季雨热同期，更有利于细菌生存。土壤真菌数量最大值出现在5月份(7.23×104菌落·g-1)，7月份土壤真菌数量为5.27×104菌落·g-1，显著低于5月份，1月份和11月份土壤真菌数量最低，数量分别是2.88×104、2.73×104菌落·g-1，但两月份之间的差异不显著，说明土壤真菌和细菌一样，在冬季生长繁殖不旺盛；放线菌数量随季节变化同样表现出显著差异，春夏季放线菌数量较高，5月份放线菌数量最高(6.75×104菌落·g-1)，依次分别是3、7、11、9月份，1月份放线菌数量仅为0.71×104菌落·g-1。

3.4 高节竹竹叶次生代谢物的变化与土壤微生物群落的关系

由表5可知，次生代谢物总量和细菌数量、微生物总量均呈现显著负相关(P<0.05)；异荭草苷与细菌数量、微生物总量均呈现显著负相关(P<0.05)；苜蓿素与真菌总量显著负相关，芹菜素与放线菌变化呈现极显著正相关(P<0.01)。

表5 竹叶次生代谢产物和土壤微生物群落变化的相关性

4 结论与讨论

季节的变化也是影响植物体内次生代谢产物积累的重要因素。本研究发现次生代谢产物主要为黄酮类次生代谢产物，次生代谢物总量最大值出现在1月份，最小值出现在7月份。与苏春花等[10]研究的结果基本一致，但与吕兆林等[9]研究结果不一致，原因是不同竹种对环境的响应不同。邓波等[15]发现青钱柳中，黄酮类次生代谢产物的含量在8月和10月明显高于其他季节；徐丽娇等[16]发现黄檗中小檗碱含量随着季节变化在各部位呈现夏季升高，秋季下降的趋势，而药根碱在不同部位中的含量也随着季节变化而有不同的规律，秋季积累量最大。研究发现高节竹竹叶中次生代谢物在秋冬季高，而在春夏季低，原因是由春季到夏季，竹子枝叶生长活动旺盛，光合作用加强，体内的有机物主要用于初生代谢，次生代谢较弱；进入秋季呼吸减慢，生长抑制剂增多，环境不利于竹子生长，次生代谢产物合成加强并不断积累。

土壤微生物在“土壤-土壤微生物-植物”生态系统中扮演重要角色。土壤微生物在土壤能量转化及养分积累过程中发挥着重要作用。土壤细菌主要参与土壤有机质转化，真菌与放线菌主要参与土壤有机物质的分解。研究表明土壤有益真菌具有促进植物生长发育和提供植物无机营养的作用[5，17]，在缓解盐压力引起的毒性发挥重要作用，因此，通过基本营养的供应使得植物吸收机理正常化。真菌主要分解纤维素、果胶和木质素等，放线菌对氨基酸等蛋白物质更高效地分解[18]。土壤微生物数量与其所处土壤环境的变化密切联系。研究发现土壤3大类微生物数量基本都是细菌最高，放线菌次之，真菌最低，这表明细菌是优势菌，这个结论与谭宏伟等[19]、王理德等[14]的研究结果一致。

不同季节土壤细菌数量差异显著，夏季土壤细菌数量最多，7月份细菌数量达到24.91×106菌落·g-1。真菌数量最大值出现在5月份；放线菌数量随季节变化显著差异，春夏季放线菌数量是秋冬季的3～6倍左右。春季温湿适宜，植物群落开始恢复生长，土壤表层存在大量未分解的动植物残体，凋落物的分解需要借助腐殖质部分的有机物质来促进非腐殖质部分的降解，真菌和放线菌可破坏凋落物表层，帮助大量内居性菌类侵入凋落物内部，分解土壤中的有机物质，供给植物吸收生长，因此春季土壤养分和真菌、放线菌数量均较高；夏季高温多雨，植物群落处于生长旺盛时期，植物根系分泌物增多，土壤养分循环与能量流动加快，需要大量的细菌参与其中，因此夏季微生物数量及代谢活性最高。这与相关的研究结果一致[20-22]。

竹叶的代谢产物丰富，竹叶凋落物在降解过程中会释放化学物质，包括很多的化感物质[23]。研究竹林对土壤微生物群落及其生态功能的影响，对于全面科学地评价竹林的生态学特性，揭示竹林对生态系统生物地球化学循环的机理具有重要意义。在杉木林、桉树林等树种中，关于植物次生代谢产物对土壤微生物群落的影响研究表明，1月份和11月份竹叶微生物活动较弱，除了温度等影响外，这段时期叶片中含有较多次生代谢物，这些物质可通过凋落物分解进入土壤，并在土壤中不断积累，抑制某些微生物的活性[24-25]。7月份微生物数量为全年最高，由于7月份的竹叶中次生代谢产物含量较少，对微生物不仅没有抑制作用，而且有一定的促进作用，由于这段时期叶片的加入，为土壤微生物提供了丰富的能量来源，提高了微生物活性[26-27]。说明植物体内次生代谢物的量和土壤微生物存着相互关系，一方面植物释放的化学物质对土壤微生物群落表现出抑制或促进作用，另一方面，土壤微生物也会通过参与土壤有机质分解、矿质元素运输而影响植物自身次生代谢物的合成。