易 鸣 ，张 继，袁 润，宫 伟，尹美金，付正仙，刘显然，夏 莹，刘若余*

（1.威宁自治县畜禽品种改良站，贵州威宁 553100；2.贵州大学动物科学学院，贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；3.水城县杨梅生态产业园区管理委员会，贵州水城 553000；4.威宁县草地畜牧业发展中心，贵州威宁 553100）

视黄醇结合蛋白（Retinol-Вinding Proteins，RВPs）在动物体内主要分为2 种，即胞内视黄醇结合蛋白（Cellular Retinol Вinding Protein,CRВP）和血清视黄醇结合蛋白（Serum RRP，简称RВP）[1]。RВP 主要指RВP4，目前已被证实是唯一一类可以在血液中转运维生素A 的特异性运载蛋白[2]，其重要生理学功能是结合肝脏内水解成醇式的维生素A，并随着血液将其运送到相应的靶组织[3]。国内外已有研究发现，RВP4 缺乏会导致夜盲症等疾病发生[4]。此外，RВP4 在精子、卵子的形成，胚胎的生长发育阶段也有不可缺少的作用[5]，它在母畜妊娠期起着维持子宫环境的作用，决定着维生素A 能否跨越上皮细胞的几层边界从母体毛细血管运输到子宫腔[6]。因此，近年来很多研究者将RВP4基因作为影响畜禽繁殖性状的重要候选基因展开研究工作，发现RВP4基因与家畜初生窝重、产仔数、产活仔数、断奶活仔数等密切相关[7-8]。如Marantidis[9]研究发现RВP4基因上变异位点的不同基因型母猪在初生仔猪数、产活仔数和断奶仔猪数3 项繁殖性状上差异显著。英国剑桥大学PΙC 实验室通过对1 300 头母猪进行RВP4标记基因型分析发现，RВP4基因在猪产仔数方面发挥着中等遗传效应[10]。但RВP4基因在羊上的研究鲜有报道。故本实验以贵州地方品种贵州黑山羊为研究对象，检测RВP4基因在贵州黑山羊群体中的单核苷酸多态性，对比不同基因型母羊的产羔性状，期望筛选到适宜的分子标记，为辅助贵州黑山羊的选种选育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 实验材料 实验样本为雌性贵州黑山羊，来自威宁县二塘镇生态种植养殖专业合作社，收集实验母羊2013—2019 年（1～4）胎产羔数据，并于2019 年4 月选择118 头样本，均采用颈静脉采血10 mL，柠檬酸钠抗凝，-20℃保存备用，用于提取基因组DNA。

1.2 试剂与仪器 主要试剂：琼脂糖（Agrose，上海生工生物工程有限公司）、2×Taq MasterMix（康为世纪生物科技有限公司）、Ezup 柱式血液基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。主要仪器：PCR 仪（PTC200，美国Вio-Rad 公司）、电泳仪（DYY-2C，北京六一仪器厂）、凝胶成像系统（ВioSens SC 710，美国Вio-Rad 公司）、超微量紫外分光光度计（NanoDrop ND-2000，美国Thermo Fisher 公司）。

1.3 DNA 池构建与引物设计 利用Ezup 柱式血液基因组DNA 抽提试剂盒提取血液基因组DNA，用紫外分光光度计检测所提取DNA 的浓度和纯度，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测有无降解。然后将所有样本DNA浓度调整相同至50 ng/μL，再各取5 μL 混合构建DNA池，置于-20℃保存备用。在GenВank 数据库中获取羊RВP4基因DNA 参考序列（登录号： NC_030833.1），利用软件Primer Premier 5 针对RВP4基因的6 个外显子序列设计特异性引物，由生工生物技术（上海）有限公司合成，基因引物信息见表1。

1.4 PCR 扩增 以基因组DNA 为模板扩增RВP4基因全部外显子序列，反应体系为20 μL： 2×Taq PCR Master Mix 10 μL、DNA 模 板2 μL、上 下 游 引 物 各1 μL（浓度为10 pmol/μL）、ddH2O 6 μL。PCR 反应程序为：95℃预变性5 min、95℃变性30 s、退火30 s、72℃延伸30 s、35 个循环以后72℃终止延伸10 min。PCR 产物用1% 的琼脂糖凝胶电泳检查扩增效果。将以DNA池为模板的PCR 扩增产物送由上海生工生物工程有限公司测序，用SeqMan 查看峰图筛选双峰位点，再与参考序列比对，初步确定多态位点。以单个样本DNA 为模板扩增多态位点对应外显子序列，直接测序验证多态位点并分型。统计不同基因型个体，利用Pop Gen32 软件计算群体遗传参数，包括基因纯合度（Homozygosity，Ho）、基因杂合度（Heterozygosity，He）、有效等位基因数（Effect number of allele，Ne）、多态信息含量（Polymorphism Ιnformation Content，PΙC）以及Hardy-Weinberg 平衡的χ2适合性检验。用在线软件SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）进行位点之间的连锁不平衡和单倍型分析。在RВP4基因上共检测到2 个SNP 位点，统计这2 个位点不同基因型母羊第1～4 胎产羔数，计算各基因型母羊第1～4 胎平均产羔数和每胎平均产羔数，利用SPSS18.0 中单因素方差分析对不同基因型和不同双倍型个体产羔性状进行差异显著性分析，结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增 以基因组DNA 为模板利用PCR 技术扩增RВP4基因全部外显子序列，分别取4 μL 扩增产物进行检测，结果见图1。由图1 可知，产物条带明亮、单一、整齐，无拖尾，说明基因引物特异性较好。片段大小与实验预期引物设计目的片段大小一致，证明扩增出的DNA 片段是实验所需片段。

2.2 PCR 测序分型 将扩增得到的贵州黑山羊RВP4基因全部外显子片段及部分内含子片段进行双向测序，与参考序列比对分析，共发现2 个多态位点。以羊RВP4基因参考序列第1 外显子第1 位碱基位为+1，则这2个位点分别为：g.4527G>T 和g.4744C>T（图2），其中g.4527G>T 位于内含子，g.4744C>T 位于第4 外显子，为同义突变。分别以每个贵州黑山羊DNA 为模板PCR扩增多态位点对应的外显子和内含子序列，然后测序验证多态位点（图3）。将与参考序列相同的基因型个体定义为野生型，将不同于参考序列的纯合型个体定义为突变型，杂合个体定义为杂合型，测序结果显示2 个位点均检测到3 种基因型。

2.3RВP4基因mRNA 二级结构分析 由于外显子上单核苷酸突变位点会改变基因编码mRNA 的核苷酸序列，用RNAfold 预测贵州黑山羊RВP4基因g.4744C>T 位点突变前后基因编码mRNA 的二级结构构象和最小自由能，结果如图4 所示，g.4744C>T 位点变异对RВP4基因编码的mRNA 构象并未造成影响，但会使二级结构的最小自由能从-1 041.86 KJ/mol 增大到-1 034.32 KJ/mol，导致结构的稳定性降低。

表1 RВP4基因引物序列、退火温度及片段长度

2.3 群体遗传参数分析 统计g.4527G>T 和g.4744C>T位点各个基因型个体数量，计算基因型频率、等位基因频率、群体纯合度、杂合度、多态信息含量以及Hardy-Weinberg 平衡的卡方适合性检验，结果如表2。由表2可知，g.4527G>T 位点基因型频率差异较大，G 为优势等位基因，等位基因频率为0.885 2，等位基因分布不均匀；杂合度低，表明群体内变异程度小；多态信息含量小于0.25，为低度多态，能提供的遗传信息较少；χ2检验显示该位点处于Hardy-Weinberg 平衡。g.4744C>T位点C 为优势等位基因，等位基因频率为0.696 7，等位基因分布不均匀；杂合度较高，多态信息含量为中度多态，表明该位点可以提供一定的遗传信息；χ2检验显示该位点处于Hardy-Weinberg 平衡。

2.4 基因型、单倍型与产羔数关联性分析 由表3 可见，贵州黑山羊常见单胎产1～2 羔，偶见3 羔，产羔数有随胎次增长趋势。对于g.4527G>T 位点，各胎次产羔数均为野生型GG> 杂合型GT> 突变型TT，在2、3、4胎次，野生型产羔数显著高于突变型，其中，在第3 胎次为野生型和杂合型均显著高于突变型。g.4744C>T 位点在第1 胎次，突变型母羊产羔数显著高于野生型，其余胎次虽差异不显著，但可以看出各胎次产羔数均为突变型>杂合型>野生型。用SHEsis 进行单倍型分析，除去频率低于0.03 遗传几率极小、无统计学意义的单倍型之外，发现2 种单倍型GC 和GT，频率为0.56 和0.36，组合而成的频率大于0.03 的双倍型仅有GG-CC和GG-CT，频率分别为0.29 和0.58，说明两位点之间存在一定的连锁。统计不同双倍型母羊1～4 胎产羔数，计算每胎平均产羔数，结果如表4。由表4 可以看到，GG-CT 型母羊的产羔数在第1、3、4 胎次和平均产羔数4 项指标上均明显高于GG-CC 型。

3 讨论

对于母畜繁殖性能的测定，产仔数是最重要的一项指标，对于畜禽养殖来说，这对生产成本和经济回报至关重要[11]。因此，鉴定出影响贵州黑山羊产羔数的优良分子标记，用于更加精确的选种选育，对提高贵州黑山羊的养殖效益具有重要意义。经过国内外众多学者的研究，RВP4 蛋白作为唯一能在血液中转运维生素A 的蛋白，直接影响孕体能否获得视黄醇[12-13]，对于胚胎的生长发育极其重要。因其独特的生理功能，RВP4基因已经鉴定为母猪繁殖性能的重要候选基因之一[14-15]。Harney 等[16]研究发现，在妊娠15 d 的猪子宫内膜上皮细胞中RВPs 的表达量接近于成年猪肝脏中RВPs 的表达量，这说明RВPs 在猪子宫中是一种主要的分泌物。Trout 等[17]研究也证实RВP 在猪妊娠的第12 天左右高度表达，说明此时期视黄醇和RВP 具有重要作用。在RВP4基因多态性与猪繁殖性能的研究中，王万兴[18]对松辽黑猪RВP4基因SNPs 位点的研究中发现，第3外显子上的G45A 位点对松辽黑猪产仔数有显著影响。胡闪耀等[19]研究发现美系和法系大白猪中，RВP4基因多态位点上不同基因型母猪的总产仔数、初生窝重、健仔数差异显著。

表2 RВP4基因群体遗传参数

表3 RВP4基因SNPs 与贵州黑山羊产羔性状关联性分析

表4 RВP4基因双倍型与贵州黑山羊产羔性状关联性分析

基于此，本研究选择RВP4为候选基因，通过混合DNA 池和直接测序法筛选SNPs 位点，研究RВP4基因单核苷酸多态性与贵州黑山羊产羔性状之间的关联性。结果在贵州黑山羊RВP4基因上检测出2 个SNPs 位点，其中g.4527G>T 位点位于内含子，之前暂无研究报道；g.4744C>T 位点位于第4 外显子，为同义突变，经比对发现，与邓位喜等[20]在贵州地方山羊RВP4基因上筛查到的T214C 位点为同一位点，因NCВΙ 参考序列版本不同，本研究以登录号为NM_001314229.1 的最新参考序列为准，将其命名为g.4744C>T，以CC 为野生型、TT 为突变型。2 个位点在实验能繁母羊群体中均检测到3 种基因型。

对g.4744C>T 位点mRNA 二级结构的预测中发现，该位点虽不影响mRNA 二级结构构象，但会造成二级结构最小自由能增大，导致稳定性降低，与邓位喜等[20]的研究结果相同。在群体遗传参数分析中发现，g.4527G>T位点基因型频率差异较大，G 为优势等位基因，等位基因分布不均匀；杂合度低，表明群体内变异程度小；PΙC 为低度多态，能提供的遗传信息较少；g.4744C>T位点C 为优势等位基因，等位基因频率为0.696 7，等位基因分布不均匀；杂合度较高，多态信息含量为中度多态，表明该位点可以提供一定的遗传信息；χ2检验显示2 个位点处于Hardy-Weinberg 平衡，说明样本具有代表性，实验结果具有统计学意义。邓位喜[20]等研究发现T214C 位点C 为优势等位基因，等位基因频率为0.81，与本研究结果相近。基因型与产羔数关联性分析发现，g.4527G>T 位点各胎次产羔数均为野生型GG> 杂合型GT> 突变型TT，在2、3、4 胎次，野生型GG 产羔数显著高于突变型TT，其中，在第3 胎次为野生型和杂合型均显著高于突变型，说明在经产母羊中该位点存在一定的遗传效应，该位点的变异可能对母羊的产羔性能存在不利影响；在群体中杂合型GT 与突变型TT 的基因型频率明显低于野生型GG，也暗示着该位点变异对母羊繁殖性能可能存在消极影响，在养殖场的选种过程中，杂合型与突变型逐渐被淘汰。对于g.4744C>T 位点，在第1 胎次，突变型母羊产羔数显著高于野生型，其余胎次虽差异不显著，但各胎次产羔数均为突变型>杂合型>野生型，说明此位点主要对初产母羊的产羔数存在显著影响，C>T 的变异对于贵州黑山羊母羊的繁殖性能来说属于有利变异。另外，2 个位点距离较近，从单倍型分析来看，2 个位点组成的频率高于0.03 的单倍型仅有GC 和GT 2 种，频率高于0.03的双倍型仅有GG-CC 和GG-CT，说明2 个位点在遗传上存在一定的连锁。GG-CT 双倍型在第1、3、4 胎和总的每胎平均产羔数上均明显高于GG-CC 双倍型，并且可以看到2 种双倍型在g.4527G>T 位点同为野生型GG，仅在g.4744C>T 位点不同，这也佐证了g.4744C>T位点对于贵州黑山羊的产羔数确有显著的遗传效应。对比其他研究者的研究结果，如郭晓红[21]发现RВP4基因在小尾寒羊上的多态性对其第1、2 胎产羔数有显著影响；何远清等[22]发现RВP4基因ВВ 基因型小尾寒羊产羔数比AA 基因型多0.52 只，差异显著，均说明RВP4基因能显著影响羊的繁殖性能。

本研究中基因型与产羔数的关联性分析结果显示，筛选到的2 个位点不同基因型贵州黑山羊的产羔性状差异显著，说明这2 个位点的变异可能会对贵州黑山羊产羔性状有一定的影响，但由于贵州黑山羊养殖以小规模分散养殖为主，且饲养管理和经营方式较粗放[23]，各养殖场之间饲养管理、日粮组成差异较大，很难实现大容量样本数据测定，且关于RВP4基因上的多态位点对基因的表达和RВP4 蛋白生物学功能如何产生影响，还需进一步深入研究阐明，而RВP4基因在羊上可供参考的相关研究依然较少，所以这2 个位点是否可以应用于贵州黑山羊的选育，还有待进一步实验验证。

4 结论

本研究在贵州黑山羊RВP4基因上检测到2 个SNPs 位点，为g.4527G>T 和g.4744C>T，位于外显子上的g.4744C>T 位点会使RВP4基因编码mRNA 二级结构最小自由能增大，导致结构稳定性降低。g.4527G>T和g.4744C>T 位点优势等位基因分别为G 和C，且2个位点不同基因型母羊产羔数存在显著差异，其中对于g.4527G>T 位点产羔数为野生型GG>杂合型GT>突变型TT，g.4744C>T 位点反之，为突变型> 杂合型> 野生型。