李钰莹，霍亚迪，杨志青，朱慧森，董宽虎

（山西农业大学 草业学院，山西 太谷030801）

禾本科早熟禾属是疏丛型或密丛型的草本植物，在我国分布约有81 种［1］。早熟禾属植物表型多样性丰富，多种该属植物被开发为应用广泛的草坪草。其中，草地早熟禾（Poa pratensis）是被引种驯化、培育和改良最早的种，亦是商品化和产业化最为成功、应用最广泛的草坪草［2］。目前，我国草地早熟禾种子仍依赖进口，其育种和制种方面的工作相对滞后。对本土现有种质资源进行遗传多样性评价，是利用本土种质资源培育新品种的基础，一方面可以了解种质资源间的遗传距离，为杂交育种或基因工程育种中亲本的选择提供数据基础；另一方面可以利用分子标记技术对基因进行定位，通过分析与目标基因紧密相关的分子标记来判断目标基因是否存在，缩短育种周期。

在我国，已有少数研究团队分别利用Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD）［3～6］、Intersimple Sequence Repeat（ISSR）［7～10］以及Amplified Fragment Length Polymorphism（AFLP）［11］分子标记技术对我国部分地区早熟禾属种质资源的遗传多样性进行了分析和评价，填补了我国草地早熟禾种质资源数据库的空白。现有文献中，更多的是针对我国西南地区、山西、甘肃和北京等地的草地早熟禾种质资源抗性生理相关的研究［12～15］，以及针对甘肃、山西等地草地早熟禾种质资源的表型性状研究［16～18］。然而，我国缺少对草地早熟禾野生资源的关注，且无标准的评价体系能够对现有的种质资源进行系统的分析，我国草地早熟禾野生种质资源的开发利用任重道远。

山西省属于典型温带大陆性季风气候［19］，地域广阔，拥有着丰富的野生草地早熟禾种质资源，具有改良和培育草地早熟禾新品种的巨大潜力。2009 年，围绕山西地形地貌较为突出的五台山、恒山、太岳山和芽庐山等地区，本研究团队开始开展草地早熟禾的种质资源收集工作。至今，共收集到49 份野生草地早熟禾种质资源，并已开展农艺性 状 评 价［18］和 抗 性 生 理 比 较［13］等 方 面 的 研 究。ISSR 分子标记技术在种质资源多样性评价中，具有扩增多态性高、重复性好和操作简便等优点。本研究选择商品种‘爱美（Aimyth）’作为外类群，通过ISSR 遗传多样性鉴定和评价技术，揭示已收集的49 份野生种质资源的遗传背景和亲缘关系，旨在为山西地区草地早熟禾种质资源的开发利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试的49 份野生草地早熟禾种质材料均采集于山西，并根据采集地的地理特征进行区域划分，共分10 个居群，采用美国商品种‘爱美’作为外类群。本研究共计50 份试验材料，具体来源见表1。

表1 50 份供试草地早熟禾样品分组及采集地信息Table 1 Gathering information of fifty Poa pratensis samples

1.2 试验方法

将所采集的49 份野生草地早熟禾种子及收集的1 份商品种‘爱美’在山西农业大学草业学院试验田进行种植。适时摘取幼嫩叶片，采用改良的十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB，Cetyltriethy lammonium bromide）提取样本材料的总DNA［20］。ISSR 引物筛选时，从已知的24 条早熟禾属常用ISSR 引物［7，8，21］中筛选出扩增谱带较多且多态性较高的10 条引物，其具体序列详见表2。ISSR −PCR 反应体系为（总体积25.0 μL）：10×PCR buf⁃fer（2.5 μL），Mg2+（2.0 mmol·L-1），dNTP（0.2 mmol·L-1），Taq 聚 合 酶（0.5 U），Primer（0.8 μmol·L-1），DNA 模 板（1.0 ng·μL-1）。ISSR −PCR 反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性45 s，50.4～57.1℃退火1 min，72℃延伸2 min，30 个循环，72℃后延伸7 min。ISSR−PCR 扩增产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳分离，Goldview 染色后置于紫外凝胶成像系统中扫描并保存图像。

1.3 统计分析

本研究中草地早熟禾野外采样点地理分布图采用Arcgis pro 2.4 制作。ISSR−PCR 扩增产物产物电泳图用Quantity One 4.6.2 软件读取谱带，辅助人工矫正，其中有谱带的标记为“1”，无谱带的标记为“0”，建立原始数据矩阵。使用PopGen 1.32 软件计算各居群间及样品间的遗传相似系数（Genetic similarity coefficient，GS）、等 位 基 因 数（Observed number of alleles，Na）、有效等位基因数（Effective number of alleles，Ne）、基因多样性指数（Gene diversity，H）和香农信息指数（Shannon's in⁃formation index，I）。使 用GenAlEx 6.5 软 件 计 算居群间多态位点比例（Percentage of polymorphic loci，PPL）。根据样品间遗传相似系数（GS），采用非加权平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA），使用NTSYSpc-2.10e 软件构建亲缘关系聚类图。

2 结果与分析

2.1 ISSR 标记多态性分析

利用筛选的10 条多态性较高的ISSR 引物对50 个样本的DNA 进行PCR 扩增，各条引物的扩增结果见表2。10 条引物共扩增出250 条清晰谱带，每条引物扩增的谱带数在16～34 条之间（图1），多态性比率在87.50%～100%之间。在250 条扩增谱带中，其中237 条谱带具备多态性，引物多态性比率达94.80%。在10 条引物中，UBC 857、UBC 835、UBC 834 和UBC 836 的 扩 增 谱 带 数 和多态性谱带数较多，对本研究中草地早熟禾样品的区分效果较好。

图1 引物UBC 811 对50 份草地早熟禾种质DNA 的ISSR-PCR 扩增结果Fig.1 ISSR amplification results of 50 populations of wild Poa pratensis with UBC 811

表2 ISSR 引物序列及其扩增结果Table 2 Primer sequence used in ISSR analyses and the amplified results

2.2 不同采集地草地早熟禾的遗传相似系数和遗传距离

由表3 可见，10 个野生草地早熟禾居群间的遗传相似系数在0.580 0～0.946 7，遗传距离在0.054 8～0.544 7。在10 个野生居群中，芽庐山居群（Group YL）和云中山居群（Group YZ）的遗传相似系数最高，为0.946 7，来自于这两个居群的草地早熟禾亲缘关系最近。而采集于朔州市右玉县地区的样品（YY）与长治市屯留县地区的样品（TL）遗传相似系数最小，为0.580 0，表明来自于这两个居群的草地早熟禾亲缘关系最远。

表3 供试草地早熟禾的遗传相似系数和遗传距离Table 3 Genetic similarity and genetic distance between different groups of Poa pratensis collected in Shanxi

育成商品种‘爱美’与山西地区野生草地早熟禾的遗传相似系数范围在0.572 0～0.762 3。其中，与长治市屯留县地区的样品（TL）遗传相似系数最小，为0.572 0；而与王屋山居群（Group WU）的遗传相似系数最大，为0.762 3。

2.3 UPGMA 聚类分析

对供试种质资源材料进行聚类分析可以分析各供试材料间亲缘关系的远近，根据山西地区野生草地早熟禾种质资源的遗传相似系数构建UP⁃GMA 聚类图（图2）。本研究以遗传相似系数0.75为阈值，将供试的10 个野生居群种质资源样品和1个商品种‘爱美’共分为5 个大类群。其中类群I 包含6 个居群，分别为太岳山居群（Group TY）、王屋山居群、云中山居群、芽庐山居群、恒山居群（Group HS）和太白山居群（Group TB）；类群Ⅱ包含五台山居群（Group WT）和朔州市应县地区（YX）的样品；类群Ⅲ为右玉地区（YY）草地早熟禾样品；类群Ⅳ为商品种‘爱美’；类群Ⅴ为屯留地区（TL）草地早熟禾样品。在UPGMA 聚类分析中，王屋山居群和太岳山居群、芽庐山居群和云中山居群、恒山居群和太白山居群地理位置较近，遗传相似性较高，两两聚在一起。在本聚类分析中，商品种‘爱美’与山西地区野生草地早熟禾种质资源之间存在遗传差异。

图2 供试草地早熟禾种质资源遗传多样性UPGMA 聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram of the analyzed Poa pratensis based on genetic distance

2.4 野生草地早熟禾居群间的遗传多样性

进行种质资源遗传多样性的分析时，在10 个野生居群中，由于部分地区种质资源丰富度较低，采集的样品数较少，因而本研究只选择其中采集样品数≥3 的7 个居群进行比较分析。表4 为7 个所选择的野生草地早熟禾居群的遗传参数，其中等位基因数介于1.228 0～1.700 0，有效等位基因数介于1.178 3～1.430 1，基因多样性指数介于0.097 1～0.247 0，香农信息指数介于0.139 8～0.368 3，多态位点比例介于22.80%～70.00%，根据香农信息指数和基因多样性指数分析，7 个野生居群的变异水平由高到低依次为Group YL>Group WU>Group YZ>Group HS>Group TY>Group TB>Group WT，其中芽庐山居群的遗传多样性最高，王屋山居群次之，而五台山居群的遗传多样性最低。根据以上遗传参数的分析，山西几个采集点间草地早熟禾种质资源的遗传多样性水平存在较大差异。

表4 山西地区7 个野生草地早熟禾居群的遗传参数Table 4 Genetic parameters of the seven groups of Poa pratensis collected in Shanxi

3 讨论

ISSR-PCR 分子标记法结合了微卫星（SSRs）分子标记法和扩增片段长度多态性（AFLP）分子标记法的优点，从而实现随机扩增多态性DNA（RAPD）分子标记法的通用性，因此被广泛应用于研究种质资源遗传多样性、系统发育、基因标记、基因组定位和进化生物学等领域［22］。2007 年，美国学者利用8 条ISSR 引物（其引物多态性比率为96%）成功将一年生早熟禾（Poa annua）及其变种区分开，因而发现ISSR 分子标记法可用于草坪草品种的鉴定，甚至利用种子进行品种的鉴定［23］。对波兰13 个野生草地早熟禾居群与3 个栽培种之间的遗传关系研究发现，与RAPD 法相比，ISSR法能够更有效、更可靠地分析草地早熟禾种质资源的遗传多样性［24］。本研究中，10 条ISSR 引物的多态性比率为94.80%，ISSR 法可有效地对山西野生草地早熟禾种质资源进行遗传多样性分析。

本研究中，7个野生草地早熟禾居群的基因多样性指数介于0.097 1～0.247 0 间，均值为0.199 2。山西野生草地早熟禾居群的基因多样性指数（0.199 2）高于青海地区的0.127 7［7］，低于青藏高原地区的0.300 1［10］。野生草地早熟禾种质资源的基因多样性指数大小很可能与样品的采样范围有关，青海地区野生草地早熟禾居群采样点紧邻试验区，采样范围较小，而青藏高原地区的野生草地早熟禾居群共计采样60 份，分别采集于青藏高原地区的不同地理位置，采样范围较广。

一个居群中种质资源的遗传多样性水平受其交配制度、物种进化史、居群进化史以及环境异质性的影响［25］。本研究中五台山居群的基因多样性指数为0.097 1，远低于7 个野生草地早熟禾种质资源基因多样性的均值。这可能是由于采样点过于集中，亦或是现有样品数量不足以表征该地区草地早熟禾的遗传多样性导致的。从草地早熟禾的繁殖特性来看，还有可能是该居群草地早熟禾更倾向于无性繁殖，因而使得其基因多样性降低。

草地早熟禾是四倍体植物，还是兼性无融合生殖植物，特殊的遗传背景和生殖特征使得草地早熟禾的遗传结构较为复杂。在本研究中，山西地区草地早熟禾的遗传相似系数为0.580 0～0.946 7，与西藏地区60 份野生草地早熟禾的遗传相似系数（ISSR 法，GS 0.525 3～0.878 8）相近［10］，与国内外的73 份草地早熟禾的遗传相似系数（SSRs 法，GS 0.56～1 之间；SRAP 法，GS 0.53～0.99）亦相近［26］。总之，野生草地早熟禾种质资源均表现出较高的遗传多样性。

与其它植物相比，同在山西地区，白羊草（Bothriochloa ischaemum）的遗传相似系数为0.818 8～0.980 1、基因多样性指数为0.172 3［27］，蒙古黄芪（Astragalus membranaceus）的遗传相似系数为0.523 8～0.706 3［28］，糜子（Panicum milia⁃ceum）和青狗尾草（Setaria viridis）的基因多样性指 数 分 别 为0.768 6 和0.660 0［29，30］。在 同 一 区 域，草地早熟禾的遗传多样性低于糜子和青狗尾草，高于白羊草，与蒙古黄芪相近。白羊草为多年生兼性无融合生殖草本植物；蒙古黄芪为多年生异花授粉草本植物；糜子为一年生自花授粉草本植物；青狗尾草为一年生自花授粉草本植物。由此推断，一年生草本植物的遗传多样性高于多年生草本植物，具有无融合生殖特征的植物其遗传多样性低于有性生殖的植物。在采集范围一定的前提下，植物的遗传多样性高低可能更多地受到本身生活史、交配系统和繁殖方式的影响，这与Hamrick 的研究结果一致［31，32］。

4 结论

根据本研究对山西地区10 个野生草地早熟禾居群（共计49 份样品）进行的遗传多样性和遗传结构的分析，山西地区不同草地早熟禾居群间基因多样性水平存在较大差异，其中地理距离较近的野生居群间其遗传相似性较高。山西地区野生草地早熟禾种质资源具备较高的遗传多样性，49 份供试野生种质资源样品与人工育成的商品种‘爱美’间存在较大的遗传距离。