党苗苗，丁海娥，杨晨曦，从丙超，赵晨，赵彩霞，邵轶群，高杨

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124）

金莲花，又称旱荷、旱莲花寒荷，为毛茛科金莲花属的植物，一年生或多年生草本。金莲花有清热解毒，消炎止痛，清热散风，平肝明目的功效。为探究金莲花内生真菌次生代谢产物活性，通过对兴隆山金莲花的内生菌分离纯化，确定其种类和数量并分析其形态学特征，为后期探究具有高度开发价值的有生物活性的天然产物新型生物资源奠定基础。

1 实验材料

1.1 实验所用植物的材料来源

采自兰州市榆中县兴隆山的金莲花，由指导老师郭俊珍老师鉴定。

1.2 仪器与设备

量筒、玻璃棒、烧杯、培养皿、锥形瓶、电子分析天平、VS-1300-U超净工作台、生化恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱

1.3 药品与试剂

75%酒精、升汞0.1%、葡萄糖、琼脂粉、注射用青霉素钠、注射用硫酸链霉素、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

2 实验方法

2.1 培养基的制作

称取200g土豆，洗去泥沙，去皮切块，利用蒸馏水煮沸至土豆成泥。用八层纱布过滤并将滤液置于烧杯中，向烧杯中加入20g葡萄糖和25g琼脂，搅拌溶解并转移至1000mL的量筒中进行稀释。分装，高压蒸汽锅灭菌，待溶液降至约55℃时加入青霉素钠和硫酸链霉素于超净工作台中倒平板，接种。

2.2 内生真菌的培养

从采样袋中挑选出叶，茎，根无损伤且无虫害的金莲花植株用无菌水冲洗干净。在超净工作台中依据组织切割法将金莲花的叶、茎和根切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，将切割好的小块于无水乙醇浸泡2min，无菌水漂洗2～3次，而后于0.1%的升汞溶液中浸泡2min再次用无菌水漂洗2～3次后，用无菌滤纸吸干表面的水分。将灭菌后的小块置于制好的培养基上，每板放置5块片，密封膜密封，于27℃的培养箱中培养3～7d。

将最后的漂洗液涂布于一个平板内一起放入培养箱中，观察是否有细菌长出，以检验上述操作是否灭菌完全。

3.3 分离纯化

菌落出现在切口。根据菌落形态，色差和生长时间，挑取每个菌落的边缘菌丝并转移到分离培养基平板进行再培养。培养数天后，观察并记录菌落的形态。最后一次冲洗后取少量表面消毒的无菌水，将其涂于含有硫酸链霉素（100U/mL）和青霉素钠（80U/mL）的分离介质上，并在30℃下孵育。观察是否有任何真菌长出作为无菌处理的参考。

将获得的菌株反复纯化并培养。菌株编号后，将其转移到PDA倾斜培养基中，置于28℃培养箱中，培养5～7d，并储存在4℃冰箱中。

4 结果

表1

从新鲜蒲公英根部（J-1）、茎部（J-2）、叶（J-3）部分离获得7株内生真菌，分别编号JH1-JH7。

5 分析

从金莲花内分离得到的内生真菌，菌落形式不一，菌丝形态也不尽相同。有丝，絮，团状，颗粒等。菌落的颜色和色素沉着有相似性。有常见的菌落颜色，如白色和黑色，以及淡黄色，灰色，浅红色等；边缘呈羽毛状，纤毛状和颗粒状等，进一步表明内生真菌的生物多样性。

6 期望

目前，随着中草药的普及与使用，中草药的开采与利用的合理性有待商榷。而中草药组织中活性物质的含量一般都较低，有且仅有某个生长阶段或组织器官中存在，很有可能会出现过度开采与利用，导致生态问题和社会问题的出现，利用植物内生真菌共生效应恰好解决了这一问题，这对保护珍稀药用植物具有重大的生态学意义[2]，那么药用植物内生真菌的分离纯化及鉴定技术则显得尤为重要。