高姣姣 曾宪伟

摘   要：为进一步开发利用华北耧斗菜资源并对其开展分子生物学研究，利用改良CTAB法提取华北耧斗菜植株的根、茎、叶、花和种子等5种组织总DNA，通过观察提取过程中各组织的表现和紫外分光光度计检测提取的总DNA，旨在找到最适宜提取总DNA的华北耧斗菜组织材料。结果表明：华北耧斗菜根、茎、叶、花和种子5种组织总DNA A260/A280比值依次为1.545、1.553、1.785、1.724、1.464，浓度为1 275 ng/μL、1 825 ng/μL、2 500 ng/μL、1 250 ng/μL、2 050 ng/μL。其中叶片总DNA提取效果最好，A260/A280比值接近纯DNA（1.8～2.0），总DNA浓度达到2 500 ng/μL。因此，华北耧斗菜叶片更适宜用改良CTAB法提取其总DNA。

关键词：华北耧斗菜;改良CTAB法;总DNA提取

文章编号： 1005-2690（2020）16-0004-03       中图分类号： S63       文献标志码： B

耧斗菜属（Aquilegia L.）植物的系统发育模式介于双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻之间，是一种新兴的模式植物[1]。因此，对其进行分子生物学研究具有重要的意义。华北耧斗菜（Aquilegia yabeana Kitag.）为毛茛科耧斗菜属多年生宿根草本植物，分布于华中、华北地区[2]。其叶型优美，花型独特似耧斗，花色深紫，花期较长，观赏价值很高，常用作园林园艺花卉。此外，作为传统中药材，华北耧斗菜具有良好的治疗月经不调、痛经等妇科疾病的作用[3]。

开展分子生物学和遗传育种学研究，提取核酸总DNA是首要且基础的任务[4]。华北耧斗菜为草本植物，富含多糖、多酚和酯类等各种次生代谢产物，且组织特异性和各组织分化程度差异较大，不同组织及部位产生的次生代谢产物种类和含量不一，各组织对试剂与提取过程各反应条件的耐受能力强弱不同，因此，各组织总DNA提取效果存在一定的差异。研究表明，采用改良CTAB法提取植物总DNA，可以较为彻底地去除植物多糖，提取的核酸质量和纯度均较好，且提取方法简单易操作[5-6]。

本研究采用改良CTAB法提取华北耧斗菜根、茎、叶、花和种子等5种不同组织的总DNA，通过观察提取过程中各组织材料的表现差异和紫外分光法测定总DNA的A260和A280，比较分析各组织总DNA提取的效果，旨在找到适宜华北耧斗菜总DNA提取的最佳组织材料，从而提取到高质量的总DNA，以期为华北耧斗菜的分子生物学研究提供一定的理论参考。

1   材料与方法

1.1   试验材料

试验材料采自吕梁学院艺术楼东侧花圃，选择生长状况良好、无病虫害的华北耧斗菜，为保证所获取组织材料的均一性，根、茎、叶、花和种子均来自于同一植株。具体取材部位为：取自根系末端部位1 cm长度，直径不超过0.2 cm的幼根;取自距离顶端幼芽1～2 cm且除去顶端幼芽及嫩叶的嫩茎;取自顶端幼芽处未展开至半展开的嫩叶;取自盛开的花朵，除去花蕾的花瓣;取自果荚里籽粒饱满、种皮青绿色的半成熟种子。

1.2   试验方法

1.2.1   改良CTAB法提取总DNA

在传统CTAB法提取植物总DNA的基础上，增加抗氧化剂和二次离心过程，具体操作方法及流程如图1。

1.2.2   紫外分光光度计测定

通常核酸分子在紫外光260 nm处具有最大的光吸收值，而蛋白质在紫外光280 nm处的光吸收值最大，在260 nm处的吸收仅为核酸的1/10或更低，故可以根据A260值和A260/A280比值分别推算出核酸浓度和DNA纯度。1 μg/mL DNA在260 nm处光吸收值为0.02，DNA浓度（ng/μL）=[A260/0.020×比色皿厚度（cm）]×稀釋倍数。DNA纯度可以根据A260/A280的比值来确定：当A260/A280<1.8，表示蛋白质含量较高;A260/A280>2.0，表示RNA含量较高;A260/A280=1.8～2.0，表示DNA较纯。

2   结果与分析

2.1   各组织总DNA提取过程效果比较

在华北耧斗菜根、茎、叶、花和种子等5种不同组织总DNA提取过程中，各组织的总DNA提取效果差异较大，见表1。

2.1.1   各组织的研磨效果

各组织研磨后的表现如图2所示，华北耧斗菜各组织都比较均匀，茎类较难研磨，存在少许纤维素，其中可能含有较多分化完全的导管与筛管细胞;根类组织变褐现象严重，可能含有较多的多酚，易氧化变黑;花类组织含有较多的水分，研磨过程中色泽淡化，且色素被β-巯基乙醇还原为黄色;叶类组织研磨效果较好，质地细腻均匀，色素较多;种子内部可能含有较多的脂类物质，研磨不够充分，为淡黄色半流体胶状物。

2.1.2   加入有机溶剂效果

加入24∶1氯仿/异戊醇结果如图3所示，根、茎、叶和种子不易与24∶1氯仿/异戊醇分散，蛋白质层较厚;花类组织材料与有机相分层明显，大部分色素溶于基层有机相，少量色素溶于上清液，多糖、蛋白质含量较少。

2.1.3   各组织离心分层效果

离心可使CTAB-蛋白质/多糖络合物加速沉淀，液体明显分为3层，上层为溶解有DNA的高盐缓冲液，中间层为CTAB-蛋白质/多糖的复杂络合物，下层为溶解有色素、酯类、酚类的氯仿/异戊醇。从图4可以看出，根类组织上清液浑浊，有较多的多酚被氧化变为褐色;茎、叶、种子类组织分层明显，上清液清透，无明显杂质，分离效果较好;花类组织上清液仍有少量色素，且中间层多糖，蛋白类沉淀较松散，导致DNA回收率较低。

2.1.4   各组织总DNA沉淀效果

由于DNA不溶于异丙醇等有機溶剂，通过离心可使其沉淀下来。离心后沉淀如图5，可以看出根的总DNA沉淀最少，且沉淀中有褐色杂质;茎的总DNA沉淀少，颜色半透明偏白;叶和种子的总DNA沉淀适中，颜色白，效果好;花瓣的总DNA沉淀少，为浅黄色，有色素杂质残留。

2.2   紫外分光光度计结果

各组织总DNA溶液紫外分光光度计检测结果见表2。

从表2可以看出，华北耧斗菜不同组织总DNA A260/A280均低于1.80，说明所提取的总DNA溶液均含有蛋白质杂质。其中，叶片总DNA A260/A280比值为1.785，最接近1.8～2.0，且总DNA浓度达到2 500 ng/μL，可初步得出5种组织中叶类的总DNA纯度、浓度均为最高，花瓣总DNA纯度次之，但其DNA浓度较低，为1 250 ng/μL，产率远远不如叶类组织，根、茎和种子的总DNA A260/A280比值均在1.5左右，表明其总DNA纯度较低，蛋白质杂质较多。

3   讨论

总DNA在植物不同组织内分布不同，含量也有所差异，组织中不同的成分对总DNA提取的纯度、浓度及产量均存在一定的影响[7]。杨运良等采用改良CTAB法对火龙果果肉、果皮、种子进行总DNA提取发现，来自同一红肉火龙果果实不同组织的总DNA浓度各不相同[8]。通过本研究对华北耧斗菜不同组织总DNA提取效果的比较发现，各组织总DNA浓度也各不相同，且A260/A280比值均在1.8以下，说明所提取的总DNA均存在一定量的蛋白质杂质，需进一步去除。

其中，根、茎、叶、花和种子等5种不同组织中，根含有较多酚类物质，褐变严重，大量杂质影响总DNA纯度，且总DNA发生降解，致使总DNA产量、纯度都较低;茎干由于细胞高度分化，部分细胞形成大量纤维素，总DNA产量、纯度一般;叶片含有大量叶绿体，总DNA含量丰富，色素易溶于氯仿，总DNA回收率高，产量、纯度都较高;花瓣细胞含有大液泡，含水量多，蛋白质/多糖成分少，离心后细胞碎片不易沉淀，导致总DNA纯度较高但产量较低;种子中积累较多的可溶性糖与蛋白质提取的总DNA存在较多杂质，是导致其纯度低的主要原因。李健仔等研究证明，叶类组织含有丰富的叶绿体DNA，其总DNA浓度与纯度等提取效果表现良好[9]，与本试验中叶类组织总DNA A260/A280比值和浓度均较高结果一致。

此外，李萌等以庙台槭叶片和果实为试验材料，探讨了这2种不同组织DNA高效提取的方法[10]。刘泊钰等分别采用了SDS法、CTAB法和试剂盒法共3种提取方法，比较分析了金线莲根、茎、叶DNA提取的效果[11]。今后可继续探究其他不同提取方法及其他影响总DNA提取效果的试验因素等，对华北耧斗菜不同组织总DNA提取进行优化，为后续更好地进行其分子生物学研究奠定基础。

参考文献：

[ 1 ] KRAME R E.Aquilegia：A new model for plant development，ecology， and evolution[J].Annual Review of Plant Biology，2009， 60（60）：261-277.

[ 2 ] 李森，袁晓娜，侯非凡，等.华北耧斗菜（Aquilegia yabeanaKitag.）的引种驯化及耐旱性评价[J].河北农业大学学报，2015，38（2）：48-71.

[ 3 ] 陈丽飞，孟缘，陈翠红，等.耧斗菜属植物研究进展[J].北方园艺，2019（20）：125-130.

[ 4 ] 孙明晓，赵婷.耧斗菜属药学研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2011（4）：83-84.

[ 5 ] 丁丽艳，何宝国，刘宇，等.植物基因组DNA提取方法综述[J].现代畜牧科技，2017（8）：6-8.

[ 6 ] 李荣华，夏岩石，刘顺枝，等.改进的CTAB提取植物DNA方法[J].实验室研究与探索，2009，28（9）：14-16.

[ 7 ] 王希，陈丽，赵春雷.甜菜不同组织、不同方法的总DNA提取方案探讨[C].中国作物学会甜菜专业委员会学术会议论文集，2018.

[ 8 ] 杨运良，李建勋，丁宵，等.改良CTAB法提取红肉火龙果果实不同组织总DNA及质量检测[J].黑龙江农业科学，2019（7）：36-38.

[ 9 ] 李健仔，李思光，罗玉萍，等.叶绿体DNA分析技术及其在植物系统学研究中的应用[J].江西科学，2002（3）：183-189.

[ 10 ] 李萌，李翔，庞晓明，等.珍稀树种庙台槭不同组织DNA 高效提取方法分析[J].分子植物育种，2019，17（4）：1228- 1237.

[ 11 ] 刘泊钰，苏春兰，陈森兰，等.金线莲不同组织DNA提取方法比较[J].现代园艺，2020，43（7）：46，166.