王业建，杨 杰，梁晓玲，阿布来提·阿布拉，韩登旭，郗浩江，刘俊，李铭东

(新疆农业科学院粮食作物研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】玉米是我国三大粮食作物之一，生长期较长，需水较多、对干旱比较敏感。而我国的干旱、半干旱地区约占全国土地面积的1/2，半湿润、甚至湿润地区也常会有周期性的、季节性的或临时性的干早，干旱成为影响玉米产量的重要限制因子，一般可使玉米减产20%～30%[1]，研究玉米响应干旱胁迫的机理对提高玉米的耐旱能力有实际意义。【前人研究进展】耐旱性是一个极其复杂的生物学过程，涉及形态结构、生理生化代谢、基因表达调控等方面的适应性变化。在玉米抗旱性鉴定的方法与指标[2]，耐旱相关性状QTLs的挖掘[3-5]，耐旱相关的功能基因和调控基因的克隆等取得了一定进展。李凤海[2]采用盆栽、田间和实验室模拟水分胁迫等手段, 选用不同杂交种和自交系，分别测定形态学、生理学、产量等指标，借助灰色关联度分析法、隶属函数值法等科学统计分析方法，对玉米抗旱性进行了系统研究, 建立了玉米抗旱性的评价体系。李春辉[5]以包含11个RIL群体、2 000个家系的温带玉米巢式关联作图群体(CN-NAM);与包含25个组合、5 000个家系的美国NAM群体(US-NAM)为研究材料, 采用田间干旱胁迫和正常水分处理，对包括ASI、株高、单株产量、穗重、穗长、行粒数和百粒重等耐旱相关性状进行连锁分析，发现CN-NAM群体的7个耐旱相关性状在正常水分条件下定位到108个QTL、在干旱胁迫下定位到91个QTL;US-NAM群体的7个耐旱相关性状在正常水分条件下定位到112个QTL、在干旱胁迫下检测91个QTL。CN-NAM与US-NAM在正常水分环境和干旱胁迫环境下的一致性QTL分别为32和18个。Mao H等[6]利用全球不同地区的368份玉米自交系组成的自然变异群体，在幼苗期进行干旱胁迫，运用全基因组关联分析，研究发现位于玉米第10号染色体上的一个编码NAC转录因子的基因ZmNAC111对玉米耐旱性起到了重要作用。Wang X等[7]利用全基因组关联分析，结合候选基因分析策略，对玉米苗期的抗旱QTLs进行扫描，克隆了一个定位于液泡膜上的质子泵-焦磷酸水解酶基因ZmVPP1，过表达该基因的植株在干旱胁迫下，耐旱性显著提高。【本研究切入点】由于玉米耐旱性的响应机制相当复杂，目前有关玉米耐旱性研究还未完全诠释在干旱胁迫下玉米基因表达调控网络。随着2代测序技术的快速发展和广泛应用，转录组测序成为了研究基因表达变化和基因表达调控网络的有效手段，已有一些报道其在水稻[8]、大豆[9]、小麦[10]、和玉米[11-13]的抗旱研究上应用。如Kaahumanu等使用转录组测序的方法发现玉米雌穗受到干旱胁迫后与细胞分裂相关的基因和ABA信号通路相关的基因表达增加，而与碳水化合物代谢、蔗糖和淀粉代谢相关的基因表达减少。但应用在玉米雄穗干旱胁迫的报道较少。开花期在玉米整个生育期中是对干旱胁迫最敏感，而从减数分裂到四分体花粉母细胞的时期又是开花期中最敏感的时期，这时的干旱胁迫可引起雄配子的发育不良，影响最终产量。但这一时期玉米响应干旱胁迫的基因表达调控网络依然不清楚。【拟解决的关键问题】研究利用RNA-seq对干旱胁迫下耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”花器官分化期的雄穗转录组表达情况进行研究，结合生物信息学分析，挖掘可能参与耐旱调控相关的基因，研究玉米耐旱的分子机理，克隆耐旱相关基因，为开展玉米耐旱遗传改良提供新的理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料为耐旱自交“PHBA6”(PHZ51×PHG47)和干旱敏感自交系“吉63”[(127-32×铁84)(W24×W20)辐)], 由新疆农业科学院粮食作物研究所提供。

于2017年在新疆农科院海南三亚科技示范园基地大棚分期播种，前期进行正常的滴灌浇水处理，待这2个自交系的雄穗处于花器官分花期时进行干旱胁迫处理，同时进行正常滴灌浇水处理作为对照，干旱处理15 d后，分别取干旱处理的“PHBA6”和“吉63”的雄穗(分别命名为PDST15和JDST15)，以及对照处理的“PHBA6”和“吉63”的雄穗(命名为PNTT15和JNTT15)，迅速包好放入液氮中, 于-80℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 雄穗花器官RNA的提取

根据试剂盒说明书，使用Trizol试剂(Invitrogen，USA)从每个样本中提取总RNA。使用NanoPhotometer分光光度计(IMPLEN,USA)和Bioanalyzer2100系统(Agilent Technologies, USA)检测RNA的纯度和完整性，质量符合标准 OD260/280 >2.0、OD260/230>1.0、RNA浓度>240 ng/μL和RIN>7.5的RNA样品进行后续的测序文库构建。

1.2.2 测序文库构建和测序

将所有的总RNA样品在杭州联川生物测序。将poly-A + RNA剪切成约200 bp的短片段，并使用随机六聚体引物和逆转录酶(Qiagen，Duesseldorf，Germany)将切割的RNA片段复制到第一链cDNA中。在含有DNA聚合酶I，RNaseH，缓冲液和dNTP(TransGen Biotech，北京)的反应体系中合成第二链cDNA。使用AMPure XP珠(Beckman Coulter，USA)纯化cDNA片段。通过PCR在反应中富集衔接子连接cDNA以产生最终的cDNA文库。在Illumina HiSeq 2000平台(Illumina，USA)上对文库进行测序。

1.2.3 测序数据的质量控制和序列比对

各样品中测序产生的原始数据Raw reads去除带有接头序列的 reads，包含 poly-N的reads，低质量的reads，最终得到clean reads。这些预处理得到的clean reads进行参考基因组比对，首先从Ensembl Plants 数据库中下载玉米参考基因组(B73_RefGen_v4)的序列文件和基因注释文件，使用Bowtie v2.2.3 软件建立序列比对参考基因组的索引，然后使用 TopHat v2.0.12 软件进行测序序列的比对。

1.2.4 干旱胁迫下差异mRNA筛选及功能富集

根据比对到参考基因组的测序结果，利用R语言的DESeq包计算基因在各样品中的表达丰度，表达丰度用FPKM值来衡量，其计算公式为：

其中Xi为i基因所测得的reads数，Li为该基因的长度，N为所测得的总reads数,采用|log2foldchange|≥1，P<0.05，FDR≤0.001筛选出样本间的差异表达基因。对筛选出的差异基因进行GO功能注释和pathway显著性富集分析，其中GO功能注释使用 Gene Ontology 数据库(www.geneontolgy.org)来预测差异表达基因的生物学功能，pathway显著性富集分析使用使用KEEG数据库来确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。

2 结果与分析

2.1 转录组测序质控和序列比对

研究表明，对4个转录组文库测序数据数据过滤和质量控制后，共产生2.27 billion 的 clean reads，除了PNTT15外，其余3组Clean reads 的总数均达到了 57 millions以上,碱基质量值是衡量测序准确度的指标,在4个文库中测序碱基质量大于Q30(测序错误率小于0.001)所占比例都均高于93%，测序结果准确可靠。分别将各库中的 clean reads 比对到玉米参考基因组，均有超过82%的 clean reads能够比对上，其中比对率最高的为JDST15，有 87.86%的 clean reads 能够比对上参考基因组。而能比对到了参考基因组的唯一位置(uniquely mapped)的clean reads平均占到能比对到参考基因组的69%，这些clean reads用于后续的表达分析。表1

表1 文库测序数据比对

2.2 干旱胁迫下差异表达基因鉴定

研究表明，得到2组差异表达基因集：JDST15-JNTT15和PDST15-PNTT15。与正常水分处理相比，干旱敏感自交系“吉63”(JDST15-JNTT15)在干旱胁迫下有1 300个差异表达基因(|log2(fold change)|>1，FDR<0.001)，其中上调表达的有691个，下调表达的有609个；耐旱自交“PHBA6”(PDST15-PNTT15)有1 394个差异表达基因，其中上调表达的有778个，下调表达的有616个；比较2个自交系中干旱和正常水分之间的差异表达基因，发现2个自交系中共有差异表达基因831个，其中共同上调表达的有425个，而共同下调的基因397个，这822个基因在干旱胁迫下的2个自交系中的上下调表达趋势是一致的，这些基因在参与玉米干旱胁迫响应时的表达模式保守，另外还有9个基因在2个自交系中具有相反的表达模式。除这些基因外，耐旱自交“PHBA6”和敏感自交系“吉63” 各自分别还有563个和469个基因型特异的干旱响应基因。表2

表2 干旱胁迫差异表达基因

2.3 差异表达基因的Gene Ontology富集

研究表明，在耐旱自交“PHBA6”中，563个特异干旱响应基因显著富集在175个GO条目上，其中富集在生物学途径121个；分子功能5个；细胞组件49 个。在生物学途径中，与胁迫相关的许多GO条目被富集，包括“response to abiotic stimulus”，“response to cadmium ion”，“response to heat”，“response to osmotic stress”，“response to oxidative stress” 等，其他富集的GO条目还包括与碳水化合物代谢(“carbohydrate metabolic process”)，有机氮化合物代谢(“organonitrogen compound metabolic process”)，细胞壁改变(“cell wall organization or biogenesis”)，激素合成调控(“brassinosteroid biosynthetic process”)，氧化还原酶活性调控(“positive regulation of oxidoreductase activity”)，分子功能主要包括“structural constituent of ribosome” , “unfolded protein binding”, 细胞组件主要包括“vacuolar membrane”, “ribosome”, “nucleolus”, “cell wall”,而在敏感自交系“吉63”中，469个特异干旱响应基因显著富集在195个GO条目上，其中富集在生物学途径143个；分子功能5个；细胞组件47 个。在生物学途径中，与胁迫相关许多GO条目也被富集，包括“response to abiotic stimulus”，“response to cadmium ion”，“response to biotic stimulus”，“response to osmotic stress”，“response to hormone” 等，其他富集的GO条目还包括与细胞壁改变(“cell wall organization or biogenesis”)，光合作用(“photosynthesis”)，形态建成(“anatomical structure formation involved in morphogenesis”)，分子功能主要包括“structural molecule activity” , “hydrolase activity”, “chlorophyll binding”，细胞组件主要包括“chloroplast thylakoid membrane”, “vacuole”, “cell wall”。图1

A：PHBA6 B：吉63

对耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”共有的831个干旱响应基因中(JDST15-JNTT15和PDST15-PNTT15差异表达基因集)，9个基因具有相反表达模式，其中5个基因在干旱敏感自交系 “吉63” 中上调表达而在耐旱自交“PHBA6”中下调表达，包括脱水素基因(Zm00001d051420)，非特异性脂转移蛋白基因(Zm00001d023343)，光系统I反应中心亚基V基因(Zm00001d020877), 蛋白激酶C受体蛋白基因(Zm00001d009480), 6-磷酸葡萄糖酸内酯酶基因(Zm00001d006185)，4个基因在干旱敏感自交系 “吉63” 中下调表达而在耐旱自交“PHBA6”中上调表达，包括60S核糖体蛋白L21基因(Zm00001d048382), 硫胺素合成酶基因(Zm00001d044228)，肽酰脯氨酰顺反异构酶基因(Zm00001d025062), 酸性核糖体蛋白P3基因(Zm00001d014679)。表3

表3 干旱胁迫下2个自交系中表达趋势相反的基因

2.4 差异表达基因的KEGG通路

在生物体内，不同基因相互协调行使其生物学功能，通过KEGG Pathway 显著性富集能确定各基因参与的主要代谢途径和信号转导途径。对同一材料不同处理条件下耐旱自交“PHBA6”的563个基因型特异的干旱响应基因进行KEGG Pathway分析，发现这些基因可以比对注释到116类 KEGG 的代谢通路中，其中6个代谢通路富集达到差异显著(P<0.05)，主要包括Ribosome，Phagosome，Citrate cycle，Biotin metabolism，Protein processing in endoplasmic reticulum和Amino sugar and nucleotide sugar metabolism，而敏感自交系“吉63” 的469个基因型特异干旱响应基因的KEGG Pathway分析表明，这些基因可以比对注释到 97类 KEGG 的代谢通路中，其中15个代谢通路富集达到差异显著(P<0.05)，主要包括Starch and sucrose metabolism, Ribosome, Phenylpropanoid biosynthesis, Amino sugar and nucleotide sugar metabolism, Oxidative phosphorylation和Pentose and glucuronate interconversions。图2

A：PHBA6 B：吉63 ji:63

3 讨 论

3.1 PHBA6和吉63 对干旱胁迫的响应存在差异

玉米雄穗花器官分化期是玉米对干旱胁迫最敏感的时期，遭受干旱胁迫会对玉米产量造成严重影响，因而在长期的进化过程中，玉米会形成适应性的响应机制。干旱胁迫下，玉米会发生多种生理生化反应，诱导或抑制各种调节蛋白和功能蛋白表达，从而对水分胁迫作出响应。在研究中，在耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”在干旱胁迫下分别有1 394和1 300个显著差异表达基因，而且上下调表达趋势一致的共有差异表达基因822个，通过功能分析发现很多基因是与非生物胁迫，细胞壁形态改变，核糖体组装，气孔运动，碳水化合物代谢相关的，表明这些基因是干旱胁迫下保守的响应基因，其参与的代谢途径也是玉米响应干旱胁迫所必须的。这与一些前人研究玉米干旱胁迫下转录组的变化一致，郝陆洋[14]对大田持续干旱处理的耐旱材料 H082183和不耐旱材料Lv28进行转录组分析，发现2个材料共有的差异表达基因显著富集于胁迫响应、代谢通路、细胞壁改变和胞外区中。

除了这些共有差异表达基因外，耐旱自交系“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63”分别还有563个和469个基因型特异的干旱响应基因，通过GO功能和KEGG通路富集分析，发现这些基因功能和参与的代谢通路不尽相同，在耐旱自交“PHBA6”中响应钙离子的基因不仅比干旱敏感自交系“吉63”多，而且绝大部分上调表达，而在干旱敏感自交系“吉63”中，上下调的基因数相差不多，另外在共有差异表达基因中，还存在10个基因具有相反的表达模式，这表明耐旱耐旱自交系“PHBA6”存在与干旱敏感自交系“吉63”不同的干旱响应机制。

3.2 与干旱胁迫相关的脱水蛋白

脱水素(dehydrin,DHN)属于LEA蛋白第二家族成员, 具有热稳定性和高亲水性，同时也具有类似分子伴侣的特性，能够稳定蛋白质的结构，是一种植物中广泛存在的亲水性蛋白。Bonhomme等[15]发现在玉米中脱水蛋白的磷酸化水平在干旱胁迫下显著提高,其磷酸化有利于其与Ca2+结合，可以对Ca2+起到缓冲的作用，具有钙依赖类分子伴侣的活性，与钙网蛋白和钙联结蛋白相似。在研究中，一个编码脱水素的基因Zm00001d051420干旱胁迫下在吉63中上升表达，而在PHBA6中下调表达，而PHBA6中特有的编码脱水素差异表达基因Zm00001d037894和Zm00001d012776 一个下调表达，一个上调表达，表明脱水蛋白在PHBA6响应干旱胁迫中具有重要作用。

3.3 与干旱胁迫相关的转录因子

转录因子在植物响应干旱胁迫的信号转导通路中具有不可取代的作用。对耐旱自交系PHBA6中的干旱胁迫特异差异表达基因的功能进一步分析，发现MYB、bZIP和ERF转录因子各1个。MYB转录因子氨基酸序列中通常含有 1～4 个串联的 MYB 结构域，可以与 DNA 分子结合。一些MYB转录因子也可以响应干旱等逆境胁迫，Wang等[16]研究发现，ZmMYB48在转基因拟南芥中过表达会增强拟南芥耐旱性，进一步证明该基因参与雄穗耐旱调控，研究中一个编码MYB转录因子的基因Zm00001d032206在耐旱自交系PHBA6受干旱胁迫后表达量上升。bZIP转录因子包括一个保守的 bZIP 结构域，其中 DNA 结合结构域能与其靶基因启动子中的顺式作用元件 ACGT 序列特异结合。bZIP 转录因子家族成员不仅能够调控植物的生长发育，而且还能够积极的参与植物的生物和非生物胁迫响应。Ying等[17]发现ZmbZIP72 被高盐和干旱胁迫诱导表达，且能够通过ABA 依赖途径积极调控转基因植株的耐盐性和耐旱性。研究发现的一个编码bZIP转录因子的基因Zm00001d039383在耐旱自交系PHBA6受干旱胁迫后表达量下降。ERF转录因子是AP2/ERF转录因子家族的一个亚家族，可以识别含GCC盒(AGCCGCC)的序列，参与应答生物胁迫，但在植物响应非生物胁迫中也具有一定的作用。Wang等[18]发现ERF转录因子GRMZM2G380377通过结合脱水响应元件发挥作用，过表达该基因的拟南芥植株对干旱胁迫和冷胁迫的抵抗能力增强。研究中一个编码bZIP转录因子的基因Zm00001d015759在耐旱自交系PHBA6受干旱胁迫后表达量上升。

4 结 论

玉米雄穗花器官分化期干旱胁迫是造成玉米减产的重要因素，耐旱相关的调控基因和功能基因在玉米耐旱性适应机制上起到重要作用。耐旱自交“PHBA6”和干旱敏感自交系“吉63” 分别有1 394和1 300个基因在干旱胁迫下表达量差异显著，并且耐旱自交“PHBA6”还具有563个基因型特异的干旱响应基因，这些基因富集分析发现参与非生物胁迫，细胞壁形态改变，核糖体组装，气孔运动，碳水化合物代谢等生物学过程，并筛选出耐旱自交“PHBA6”中在干旱胁迫下差异表达的3个脱水素基因和3个特有差异表达的bZIP、MYB和ERF转录因子。