钟文 黎露清 叶敏

摘要：以人参、红花为对照药材进行薄层色谱鉴别;采用高效液相色谱法测定制剂中延胡索乙素含量，建立参红祛瘀散结颗粒的质量标准。结果表明，人参对照药材和红花对照药材薄层图谱斑点清晰，分离效果好，专属性强，阴性对照无干扰;延胡索乙素在7.174～35.940 μg/mL（r=0.999 89）与峰面积线性关系良好，平均加样回收率良好，说明该方法简便准确、重现性好，可用于参红祛瘀散结颗粒的质量控制。

关键词：参红祛瘀散结颗粒;延胡索乙素;薄层色谱;高效液相色谱法

中图分类号：R282.71         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）15-0136-04

Abstract： Thin layer chromatography was used to identify ginseng and safflower as control materials. The content of fumarate in the preparation was determined by high performance liquid chromatography，to establish the quality standard of Shenhong Quyu Sanjie granules. The results showed that the thin-layer atlases of the ginseng control medicine and the safflower control medicine showed clear spots， good separation effect， strong specificity， and no interference in the limit control. It has a good linear relationship with the peak area in 7.174～35.940 μg/mL（r=0.999 89）. The average sample recovery was good. The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control method of Shenhong Quyu Sanjie granules.

Key words： Shenhong Quyu Sanjie granules; yanhusuosutin; thin layer chromatography; high performance liquid chromatography

参红祛瘀散结颗粒是由人参、红花、醋延胡索、黄连、黄芪、党参等16味中药组成的制剂。由参红祛瘀散结胶囊改变制剂而成，具有益气养血、活血化瘀的功效;适用于气虚血瘀证的癌症患者化疗时的辅助治疗。参红祛瘀散结颗粒保持原剂型的提取工艺不变，仅改变制剂成型工艺，将其制成参红祛瘀散结颗粒。为使新制剂质量可控，本研究制定了参红祛瘀散结颗粒质量标准。

1 材料与方法

1.1 仪器

日本岛津（Shimadzu）全自动HPLC仪，包括SPD-M20A二极管阵列检测器、SIL-20AC自动进样器、LC-20AD溶液传输单元、CTO-20AC色谱柱柱温箱和CBM-20A系统控制器;色谱柱Phenomenex  Gimini-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），梅特勒-托利多分析天平（瑞士）。

1.2 样品

参红祛瘀散结颗粒由广西圣保堂健康产业股份有限公司提供，批号：170901、170902、170903、170904、170905、171002、180101、180102、180103、180104、180105、180106。

1.3 试剂

延胡索乙素对照品，中国药品生物制品检定所提供，批号：110726-201713，供含量测定用;人参对照药材，中国药品生物制品检定所提供，批号：170947-201110，供鉴别用;人参皂苷Re对照品，中国药品生物制品检定所提供，批号：170754-200421，供鉴别用;红花对照药材，中国药品生物制品检定所提供，批号：170907-200609，供鉴别用。色谱甲醇为美国Fisher公司提供，甲醇、乙醇和磷酸为分析纯，试验用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.4 方法

1.4.1 人参药材的薄层色谱鉴别试验 样品研细，称取20 g，加三氯甲烷60 mL，水浴加热回流1 h，放冷，弃去三氯甲烷，药渣挥干，加2 mL超纯水拌匀，加水饱和正丁醇20 mL，加热回流1 h，放冷，取正丁醇，加氨试液30 mL，搖匀，静置分层，取正丁醇置水浴蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取未加人参的阴性样品20 g，同法制成阴性样品溶液。另取人参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取人参皂苷Re对照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，作为对照品溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液10 μL、对照药材溶液和对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以[正丁醇-醋酸乙酯-水（4∶1∶5）的上层液]-甲醇（10∶1）为展开剂，置氨蒸气预饱和15 min的层析缸内10 ℃以下展开，取出晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热约5 min，使色谱图中斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点;在与对照药材色谱相应的位置上，至少显3个相同颜色的斑点，阴性对照试验结果无干扰（图1）。

1.4.2 红花药材的薄层色谱鉴别试验 样品研细，称取30 g，加醋酸乙酯40 mL，水浴回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酸乙酯1 mL溶解，作为供试品溶液。取未加红花的阴性样品30 g，同法制成阴性样品溶液。另取红花对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。参照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部通则0502）试验，吸取上述2种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-甲酸（8∶8∶1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照试验结果无干扰（图2）。

1.4.3 色谱条件 色谱柱：Phenomenex  Gimini- C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（56∶44）（用三乙胺调节pH 6.0）;流速1.0 mL/min;检测波长230 nm;柱温为30 ℃。进样量为20 μL，理论塔板数以延胡索乙素计算应不低于3 000，相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.08。在此色谱条件下，延胡索乙素峰形良好，与溶剂峰完全分离，证明此分离条件可行。

1.4.4 对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成15 μg/mL即得延胡索乙素对照品溶液。

1.4.5 供试品溶液制备 样品研细，取约5 g置具塞锥形瓶中，精密加入浓氨-甲醇（1∶20）试液25 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用浓氨-甲醇（1∶20）试液补足失量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.4.6 阴性对照样品溶液的制备 取未加醋延胡索的阴性样品约5 g，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2 结果与分析

2.1 干扰试验

取延胡索乙素对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液进行测定。结果表明，阴性对照溶液色谱中，在延胡索乙素峰相应的保留时间无吸收峰，表明处方中其他成分对测定无影响（图3）。

2.2 线性关系

精密称取延胡索乙素对照品17.97 mg（批号：110726-201713，按99.8%计，中国药品生物制品检定所）置50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得0.358 7 mg/mL的对照品溶液，备用。分别精密吸取以上对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样测定。以对照品含量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：

Y=4.626 79×10-5X - 0.311 126（r=0.999 89）

将系列对照品溶液分别进样，测定其信号（以峰高计）与噪声比值，将S/N=3时的浓度定为检测限（LOD），将S/N=10时的浓度定为定量限（LOQ），检测限为4.2 ng/mL，定量限为31.5 ng/mL。结果表明，延胡索乙素在7.174～35.940 μg/mL，进样量20 μL与延胡索乙素峰面积呈良好的线性关系。

2.3 精密度试验

对同一供试品（批号171002），按样品的制备方法制成供试品溶液，连续测定6次，结果测得延胡索乙素各峰面积RSD为0.10%（n=6），小于3.00%，表明精密仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验

对同一供试品溶液（批号171002），分别在供试品溶液制备后0、2、4、7、9、11、13、15、18、24 h测定峰面积，结果测得延胡索乙素峰面积RSD为0.31%（n=10），小于3.00%，表明样品在24 h内稳定。

2.5 重复性试验

同一批供试品（批号171002）称取6份，按样品的制备方法制成供试品溶液，按色谱条件分别检测，结果测得延胡索乙素的平均含量为90 μg/袋（RSD =1.54%，n=6），表明该方法的重复性良好。

2.6 回收率试验

取已知含量的供试品（批号为171002，含量为90 μg/袋，规格3 g/袋）2.5 g，共9份，分成3组，每组3份，分别精密添加浓度为89.68 μg/mL的延胡索乙素对照品溶液0.6、0.8、1.1 mL，按“1.4.3”色谱条件测定，并计算延胡索乙素的平均回收率和RSD值。结果表明，该方法具有良好的回收率（表1）。

2.7 样品的测定

取不同批号的样品制备供试品溶液，按“1.4.3”色谱条件测定。由表2可知，10批次样品延胡索乙素含量为67.6～89.8 μg/袋，RSD为0.49%～1.64%。

3 讨论

3.1 流动相的选择

试验考察了甲醇-0.05%磷酸、甲醇-0.10%磷酸、甲醇-0.20%磷酸、甲醇-0.30%甲酸、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.10%磷酸、乙腈-0.20%磷酸、乙腈-0.30%甲酸、甲醇-水、乙腈-水等对样品成分分离效果的影响[1]，结果表明，甲醇-0.10%磷酸溶液作为流动相时，分离度较好，故流动相确定为甲醇-0.10%磷酸溶液。

3.2 波长的选择

采用二极管阵列检测器，在200～400 nm波长下对供试品和对照品溶液进行全波长扫描，延胡索乙素在230、280、285 nm波长下有最大吸收[2-4]。考虑到230、285nm作为检测波长时，溶剂峰大，基线漂移，而用280 nm时，溶剂峰小，基线平稳，延胡索乙素响应值较大，故最终采用280 nm作为本试验的检测波长。

参红祛瘀散结颗粒的质量标准是在查阅大量文献、参照《中国药典》2015年版，并经过试验研究而拟定。质量标准中选择人参、红花药材的有效成分作为鉴别项，试验结果表明，参红祛瘀散结颗粒有独特的荧光斑点，且阴性样品无干扰，说明本试验最终确定的鉴别方法专属性好，可作为该制剂的定性控制方法。

本试验以醋延胡索药材中的有效成分延胡索乙素为含量测定指标，并进行了相关的试验研究和含量测定方法学考察。试验研究过程中，对色谱条件和系统适应性试验进行了相关的研究和考察;对不同流动相组成及比例进行了优选;在样品溶液的制备中，特别是供试品溶液的制备，对不同溶剂及用量等进行了优选，确定最佳供试品溶液制備方法，试验结果表明，该方法快速、简便、准确，分离度好，回收率高，结果可靠。

该质量标准的研究，不仅能有效控制参红祛瘀散结颗粒的质量，符合2015版《中国药典》、新药研制技术规范和《药品注册管理办法》要求，而且其定性、定量方法简单，准确可控，重复性好，可用于参红祛瘀散结颗粒的质量控制。

参考文献：

[1] 魏江存，陈 勇，谢 臻，等. 10批不同产地六棱菊中咖啡酸的工艺优化与含量测定[J]. 中国药房，2017，28（34）：4792-4795.

[2] 王 欢，毕福钧，林 彤，等. 延胡索HPLC指纹图谱研究及9种生物碱含量测定[J]. 中药材，2017，40（3）：624-629.

[3] 刘长龙，李云霄，钱 俊，等. 响应面法优化十味盆安颗粒虎杖醋延胡索的提取工艺研究[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2016，18（9）：1602-1608.

[4] 葛秀允，孙立立. 市售延胡索颗粒和醋延胡索颗粒质量分析[J]. 齐鲁药事，2012，31（11）：636-637.