郑永征,刘光辉,潘铭东

0引言

眼内炎是眼科手术的严重并发症，严重影响视力。术前结膜囊内聚维酮碘消毒是最为有效地预防术后眼内炎的方法[1]。目前国内外主要使用50g/L聚维酮碘结膜囊内消毒3min[2-3]。但部分患者术后出现眼干、眼痛等角膜刺激征。2017年《我国白内障摘除手术后感染性眼内炎防治专家共识》建议对眼表有问题患者使用10g/L或低于50g/L聚维酮碘结膜囊消毒[4]。聚维酮碘是广谱杀菌消毒剂，聚维酮碘杀菌的主要原理是氧化损伤。聚维酮碘在水中能缓慢释放出游离碘，游离碘可与菌体蛋白的氨基酸结合使其变性，游离碘还可氧化细菌蛋白中的SH-、OH-、NH-等活性基团和不饱和脂肪酸的双键，从而灭活微生物的活力，杀灭微生物，抑制微生物繁殖、释放毒素[5]。但聚维酮碘的作用没有特异性。除微生物外，它还可以作用于正常的角膜上皮细胞。本研究通过体外培养角膜上皮细胞，研究聚维酮碘对角膜上皮细胞氧化损伤的影响。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞来源人角膜上皮细胞株(Scien Cell，Cat.6510)。

1.1.2试剂及仪器50g/L聚维酮碘(上海利康消毒高科技有限公司)，DMEM培养基、小牛血清、2.5g/L胰酶(美国HyClone)，CCK-8试剂盒(碧云天生物技术公司)，人丙二醛(malondialdehyde,MDA)、人超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA试剂盒(MDA：CSB-E08557h；SOD：CSB-E08554h，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，Annexin V-FITC/PI流式试剂盒(美国Beckman Coulter)。酶标仪(美国Thermo公司，软件版本SkanIt Software 5.0 for Microplate Readers RE,ver.5.0.0.42)。

1.2方法

1.2.1细胞培养角膜上皮细胞接种于直径10cm的培养皿，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培养基10mL，置于37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱内培养，2d后换液一次，细胞融合达80%时按照1∶3传代。选取生长良好的对数期细胞用于实验。

1.2.2实验分组及处理

1.2.2.1不同浓度聚维酮碘对角膜上皮细胞的影响取体外培养的生长良好的角膜上皮细胞按随机数字法分为：对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组。低浓度组采用10g/L聚维酮碘孵育3min，中浓度组采用25g/L聚维酮碘孵育3min，高浓度组采用50g/L聚维酮碘孵育3min。然后使用PBS润洗3次，每次2min，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培养基培养24h。采用ELISA检测各组MDA、SOD含量，采用CCK-8法检测细胞活性，倒置显微镜观察角膜上皮细胞形态，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.2.2.2不同消毒时间聚维酮碘对角膜上皮细胞的影响取体外培养的生长良好的角膜上皮细胞按随机数字法分为：对照组、短时间组、中等时间组和长时间组。短时间组采用50g/L聚维酮碘孵育1min，中等时间组采用50g/L聚维酮碘孵育2min，长时间组采用50g/L聚维酮碘孵育3min。然后使用PBS润洗3次，每次2min，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培养基培养24h。采用ELISA检测各组MDA、SOD含量，采用CCK-8法检测细胞活性，倒置显微镜观察角膜上皮细胞形态，采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。

1.2.2.3 ELISA检测各组MDA含量各组细胞接种于6孔培养板中，每孔1mL培养基，每组各设3个复孔。按处理因素处理后培养24h，吸走培养液，PBS润洗3次，每孔加入200μL细胞裂解液后置于摇床5min，用细胞刮反复刮底壁，将所得细胞溶液转移入冰浴的1.5mL EP管中，4℃ 12 000g离心10min，取上清液作为待测样品。按试剂盒说明书取100μL细胞裂解上清液，200μL MDA检测工作液，混匀后100℃ 15min，冷却至室温，1000g离心10min，取200μL上清液到96孔板中，采用532μm波长检测OD值，通过标准曲线计算其含量。

1.2.2.4 ELISA检测各组SOD含量各组细胞接种于6孔培养板中，每孔1mL培养基，每组各设3个复孔。按处理因素处理后培养24h，吸走培养液，PBS润洗3次，每孔加入100μL SOD样品制备液后置于摇床5min，用细胞刮反复刮底壁，将所得细胞溶液转移入冰浴的1.5mL EP管中，4℃ 12 000g离心10min，取上清液作为待测样品。按试剂盒说明书取20μL细胞上清液，160μL WST-8/酶工作液，20μL反应启动工作液，混匀后37℃孵育30min，采用450μm波长检测OD值，通过标准曲线计算其含量。

1.2.2.5 CCK-8法检测细胞活性检测时各组细胞接种于96孔培养板中，每孔100μL培养基，每组各设3个复孔。按处理因素处理后培养24h，更换新鲜培养基每孔100μL，每孔再加入10μL CCK-8试剂，细胞培养箱孵育2h后，采用420μm波长检测OD值。

1.2.2.6 Annexin V-FITC/PI测细胞凋亡各组细胞接种于直径10cm的培养皿，每孔10mL培养基，每组各设3个复孔。按处理因素处理后培养24h，吸走培养液，PBS润洗3次，用2.5g/L胰酶消化为单个细胞，1000g离心3min。2mL PBS重悬细胞并且计数，使细胞密度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液加入Annexin V-FITC抗体5μL和PI抗体5μL，避光室温孵育15min后加入400μL结合缓冲液，流式细胞仪上机检测各组细胞的凋亡率。

统计学分析：采用统计学软件SPSS22.0进行分析。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步使用LSD-t检验进行多重比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 ELISA检测聚维酮碘对角膜上皮细胞MDA含量的影响对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组中角膜上皮细胞MDA含量分别为4.182±0.306、9.269±0.106、12.282±0.263、17.733±0.423nmol/L。聚维酮碘浓度越高，角膜上皮细胞的MDA含量越高，组间差异具有统计学意义(F=1092.91，P<0.01)。对照组、短时间组、中等时间组和长时间组MDA含量分别为4.195±0.261、12.123±0.557、15.194±0.476、17.583±0.554nmol/L。聚维酮碘消毒时间越长，角膜上皮细胞的MDA含量越高，组间差异具有统计学意义(F=454.51，P<0.01)。

2.2 ELISA检测聚维酮碘对角膜上皮细胞SOD含量的影响对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组中角膜上皮细胞SOD含量分别为7.132±0.370、6.815±0.185、6.422±0.338、5.866±0.234U/mg。聚维酮碘浓度越高，角膜上皮细胞的SOD含量越低，组间差异具有统计学意义(F=10.481，P<0.01)。对照组、短时间组、中等时间组和长时间组SOD含量分别为7.148±0.316、6.320±0.318、6.050±0.196、5.832±0.254U/mg。聚维酮碘消毒时间越长，角膜上皮细胞的SOD含量越低，组间差异具有统计学意义(F=13.112，P<0.01)。

2.3 CCK-8法检测聚维酮碘对角膜上皮细胞活性的影响对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组中角膜上皮细胞活力分别为1.269±0.055、1.192±0.061、1.042±0.077、0.892±0.038。聚维酮碘浓度越高，角膜上皮细胞的活性越低，组间差异具有统计学意义(F=23.547，P<0.01)。

图1 不同浓度聚维酮碘对角膜上皮细胞的影响(×200) A：对照组；B：低浓度组；C：中浓度组；D：高浓度组。

图2 不同消毒时间聚维酮碘对角膜上皮细胞的影响(×200) A：对照组；B：短时间组；C：中等时间组；D：长时间组。

对照组、短时间组、中等时间组和长时间组中角膜上皮细胞活力分别为1.260±0.024、1.119±0.043、1.001±0.042、0.876±0.062。聚维酮碘消毒时间越长，角膜上皮细胞的活性越低，组间差异具有统计学意义(F=39.816，P<0.01)。

2.4倒置显微镜观察聚维酮碘对角膜上皮细胞的影响不同浓度聚维酮碘对角膜上皮细胞的影响见图1。对照组角膜上皮细胞呈多角形，排列规则，透光性好；聚维酮碘消毒后部分角膜上皮细胞变性，活性下降，出现皱缩，透光性降低，甚至出现凋亡小体，聚维酮碘浓度越高，变性的角膜上皮细胞越多。不同消毒时间聚维酮碘对角膜上皮细胞的影响见图2。对照组角膜上皮细胞呈多角形，排列规则，透光性好；聚维酮碘消毒后部分角膜上皮细胞变性，活性下降，聚维酮碘消毒时间越长，变性的角膜上皮细胞越多。

2.5聚维酮碘对角膜上皮细胞凋亡率的影响对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组中角膜上皮细胞凋亡率分别为3.35%±0.13%、6.50%±0.35%、8.41%±0.10%、15.33%±0.27%。聚维酮碘浓度越高，角膜上皮细胞的凋亡率越高，组间差异具有统计学意义(F=1386.175，P<0.01)。对照组、短时间组、中等时间组和长时间组中角膜上皮细胞凋亡率分别为3.37%±0.28%、8.12%±0.48%、11.31%±0.37%、15.50%±0.271%。聚维酮碘消毒时间越长，角膜上皮细胞的凋亡率越高，组间差异具有统计学意义(F=598.196，P<0.01)。

3讨论

术前杀灭结膜囊细菌是预防术后眼内炎的重要措施。术前滴用抗生素眼液，术前用等渗盐水或抗生素冲洗结膜囊，术前结膜囊内聚维酮碘消毒均可降低结膜囊细菌数量，但术前结膜囊内聚维酮碘消毒是最为有效的方法[1]。聚维酮碘是广谱杀菌消毒剂，可直接杀灭细菌、病毒、真菌、芽孢与原虫。大多数细菌30s内可杀灭[5]。聚维酮碘杀菌的主要原理是氧化损伤。聚维酮碘在水中能缓慢释放出游离碘，游离碘可氧化菌体蛋白的氨基酸使其变性[5]。聚维酮碘不含酒精，对皮肤黏膜刺激小，是黏膜的首选消毒剂。

聚维酮碘的作用没有特异性。除微生物外，它还可以作用于正常细胞。高浓度的聚维酮碘对组织细胞有一定的毒性，聚维酮碘结膜囊消毒时，结膜和角膜上皮细胞直接接触聚维酮碘，局部浓度越高，细胞毒性也越大。我们研究发现聚维酮碘消毒后角膜上皮细胞的MDA含量升高，SOD含量降低，细胞活性降低，部分角膜上皮细胞变性，出现皱缩，透光性降低，甚至出现凋亡小体，凋亡率增高。正常结膜和角膜上皮细胞内氧化系统和抗氧系统处于相对平衡状态，体内产生的自由基会被抗氧系统及时淬灭，维持体内自稳状态[6]。聚维酮碘结膜囊消毒时，游离碘在氧化细菌蛋白的同时，也可以氧化结膜和角膜上皮细胞中的蛋白，甚至细胞核内DNase活性。这时突然产生的大量自由基超过机体抗氧化系统的清除能力，结膜和角膜上皮细胞处于氧化应激状态。细胞膜或细胞核模上的磷脂、酶和膜受体上的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质可因氧化应激产生脂质过氧化物。MDA是细胞膜脂过氧化的重要产物，MDA含量升高影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性，激活P38、JNK、CDC42、JAK、PI3K/Akt、自噬等信号途径，进而转录NF-κB、STAT和EGR1，激活细胞核内DNase活性引起DNA损伤，诱导细胞凋亡[6-9]。SOD是体内的一种抗氧化金属酶，人体内有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD两类。SOD通过金属离子如Mn+1(氧化态)和Mn(还原态)的交替电子得失实现催化作用。超氧阴离子自由基与金属离子形成配合物，Mn+1被还原为Mn，同时生成氧，Mn又被HO2氧化为Mn+1，同时生成过氧化氢，SOD又被氧化为初始氧化态的SOD。最后，H2O2在过氧化氢酶的作用下，被催化分解为水和氧。SOD催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，消除体内超氧自由基，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，保护机体免受氧化损伤，减少由于氧化损伤引起的细胞凋亡[6，10-12]。聚维酮碘消毒后角膜上皮细胞的MDA含量升高，SOD含量降低，提示聚维酮碘对角膜上皮细胞也会产生氧化损伤，导致细胞活力下降，细胞凋亡增加。Chou等[5]研究发现聚维酮碘可抑制人角膜纤维细胞和人角膜上皮细胞中的线粒体脱氢酶和细胞内酯酶活性，包括DNase活性。尽管细胞形态没有改变，但细胞生长受到抑制并且细胞膜完整性被破坏，细胞对外部刺激没有反应，认为聚维酮碘通过固定而不是细胞凋亡或坏死导致人角膜纤维细胞和人角膜上皮细胞死亡。

我们研究还发现聚维酮碘消毒后对角膜上皮细胞的氧化损伤呈浓度和时间依赖性。聚维酮碘浓度越高，角膜上皮细胞的MDA含量越高，SOD含量越低，细胞活性越低，凋亡率越高。聚维酮碘消毒时间越长，角膜上皮细胞的MDA含量越高，SOD含量越低，细胞活性越低，凋亡率越高。这与Shibata等[13]报道的聚维酮碘对角膜上皮具有一定细胞毒性，且其毒性呈浓度依赖性一致。增加聚维酮碘浓度和延长消毒时间会增加碘向角膜的渗透量，并可能导致角膜上皮和基质细胞的毒性，结膜囊内残留的聚维酮碘可能进入前房，损伤角膜内皮细胞。Jiang等[14]通过角膜荧光染色和角膜厚度测量仪检测不同浓度聚维酮碘对角膜的毒性，研究发现50g/L和25g/L的聚维酮碘结膜囊消毒可引起严重的上皮损伤，20g/L和15g/L的聚维酮碘前房注射后可引起明显的角膜水肿、角膜增厚。认为5g/L或10g/L聚维酮碘结膜囊消毒是安全可行的。封艳等[15]报道2.5g/L聚维酮碘已可达到消毒作用，较5g/L聚维酮碘相比患者主观舒适度更好，球结膜充血、角膜上皮损伤更轻。樊芳等[16]报道50g/L聚维酮碘结膜囊冲洗30s能有效减少结膜囊细菌，对眼表的损伤小，白内障术前结膜囊消毒是安全有效。Alp等[17]将50g/L和100g/L聚维酮碘注入前房一滴，均可引起严重的角膜毒性，认为聚维酮碘结膜囊消毒必须防止聚维酮碘渗漏进入前房。张硕基等[18]报道白内障摘除术前使用50g/L聚维酮碘结膜囊消毒2.0min或3.5min较30s或1.0min更有效减少术前结膜囊细菌数量，消毒2.0min术后1h的角膜上皮损伤好于3.5min，认为50g/L聚维酮碘结膜囊消毒2.0min是安全有效地预防感染措施。

综上所述，聚维酮碘对角膜上皮细胞有氧化损伤作用，损伤呈浓度和时间依赖性。在保证结膜囊灭菌效果的情况下，适当降低使用浓度或消毒时间，可以有效减少角膜上皮损伤。

2中国医师协会眼科医师分会, 中华预防医学会医院感染专业委员会, 中华预防医学会消毒分会, 等. 我国眼科手术管理、感染控制、消毒灭菌指南(一). 中华眼科杂志2016;52(3)：167-173