周义方，喻斌，徐寅，曾蓉，陈末

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410208)

自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，HP)被发现以来，其生理结构、致病特点以及相关病理机制一直是研究的热点，目前已被众多学者研究证实其是一种慢性且具有传染性的致病菌，据统计全球范围内有50%以上人类感染了HP，导致胃黏膜慢性炎症的发生[1-2]。HP相关性胃炎(HAG)就是HP感染后引起胃及十二指肠发生炎性变化。一些胃肠疾病的发生(如胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等)与HP有着密切的关系，其也被证明可以大大增加胃癌的发生率[3-4]。基于以上的危害因素，根除HP对于治疗胃肠疾病显得非常重要。通常西医以四联疗法根除HP为主，由于西医四联根除HP疗法导致的高耐药性、肠道菌群紊乱、高复发率等问题，以及中医药在HAG的防治方面有着显著的疗效，所以我们从中医药防治HAG角度出发开展研究。目前研究得出的结果有：在对HAG患者的中医证型进行统计及分析的基础上，发现脾胃湿热证型者最多；脾胃湿热证与HP感染这两者之间有着密切的关联性；对HAG脾胃湿热证予以具有清热祛湿方药进行干预治疗可取得显著疗效[5-10]。前期研究明确了HAG的发病机制，从而为中医药防治HAG提供更多理论依据。

研究[11-12]发现HP可以通过多种不同的机制来诱导胃黏膜细胞发生凋亡；同时研究[13-15]发现脾胃湿热证模型胃黏膜细胞的促凋亡蛋白呈过度表达。然而在HAG患者中又以脾胃湿热证型为多，所以认为HAG脾胃湿热证与胃黏膜细胞凋亡有着密切的联系。Fox转录因子的O亚家族(subfamily O of forkhead transcription factors, FoxO)在细胞周期的调控和程序化细胞死亡中起重要作用，但它在HAG脾胃湿热证中的意义尚不清楚[16]。因此，基于HAG脾胃湿热证的病机和FoxO的生物学功能，我们认为胃黏膜上皮细胞凋亡是HAG脾胃湿热证的重要病理机制，其机制与FoxO信号通路的调控作用相关。

在本课题组前期研究基础上[6-10]，本实验采取复合病因的造模方法来建立HAG脾胃湿热证小鼠模型，以FoxO信号通路参与细胞凋亡调控为基础，以HAG脾胃湿热证小鼠模型为研究对象，检测并分析FoxO信号通路相关物质(PTEN、FoxO3a、PI3K、Akt)的表达情况，以此来分析和阐明HAG脾胃湿热证小鼠模型胃黏膜发生的细胞损伤与FoxO信号通路调控细胞凋亡的关系。

1 材料、试剂与仪器设备

1.1 实验材料

实验动物：60只SPF级BALB/c小鼠(雌雄各半，约8周龄，体质量20～30 g)。实验饲料：普通饲料和高脂饲料；高脂饲料(自制)：普通饲料按等比例加入蜂蜜和猪油。HP菌株：含有细胞毒素相关基因(cag A)和空泡细胞毒素(vac A)且浓度为1×109cFU/mL的悉尼菌株。

1.2 主要实验仪器

显微镜，Motic；台式高速冷冻离心机，湘仪；全自动酶标洗板机，汇松；多功能酶标分析仪，汇松；恒温培养箱，光明；Tunel试剂盒(KGA704)，凯基生物；内源性亲和素—生物素封闭试剂盒，北京雷根生物；电泳仪，美国Bio-rad；电泳槽，中国北京六一；转膜仪，中国北京六一；旋涡混合器，中国江苏其林贝尔；荧光定量RCP仪，Thermo；荧光PCR板，Thermo；恒温水浴箱，河南金博；人工湿热箱，自制。

1.3 主要实验试剂

中性树胶，Sigma；苏木素，Wellbio；PBS(7.2-7.6)，Wellbio；枸橼酸盐缓冲液，Wellbio；二步法试剂盒，中杉金桥；DAB试剂盒，中杉金桥；伊红，Wellbio；HRP goat anti-mouse IgG，美国Proteintech；RIPA裂解液，中国长沙维世尔生物；蛋白酶抑制剂，德国Merck；蛋白磷酸酶抑制剂，瑞士Roche；HRP goat anti-rabbit IgG，美国Proteintech；SuperECL Plus 超敏发光液，美国Thermo pierce；显影液 定影液，中国WellBiology；快速尿素酶检测试剂盒，上海国药生物；PTEN(抗体货号 60300-1-Ig)，美国proteintech；PI3K(抗体货号 60225-1-Ig)，美国proteintech；P-AKT(抗体货号4060s)，美国CST；FOXO3a(抗体货号10849-1-AP)，美国proteintech。

2 实验方法

2.1 动物分组

将60只SPF级BALB/c小鼠随机分成5组，每组各12只。室温条件(20～25 ℃)下适应性饲养3 d。正常对照组：正常饮食+自然环境+同步饲养。内湿HP组：自然环境+HP菌液(致病因子)+肥甘饮食(内湿)。外湿HP组：正常饮食+HP菌液(致病因子)+湿热环境(外湿)。单纯HP组：正常饮食+自然环境+HP菌液(致病因子)。复合病因造模组：肥甘食物(内湿)+湿热环境(外湿)+HP菌液(致病因子)。

2.2 造模方法

复合病因组造模方法：开始造模的第1天即开始予以高脂饲料(即普通饲料按等比例加入蜂蜜和猪油)，饲养至第13天后开始进行外部湿热条件的干预，将其放入自制的湿热箱中温度(32±2)℃，湿度95%每天6 h，至第18天的时候开始进行HP的接种，隔日感染1次，总共感染3次，接种后定植2周，种植HP及定植期间其余条件均不变。第37天取出小鼠检测指标。接种HP方法如下：所有BALB/c小鼠在给予HP菌液灌胃前，先禁食不禁水24 h，模型组小鼠灌注1×109cFU/mL浓度的CagA+VacA+菌株HP 菌液0.3 mL/只，灌胃后4 h给予食物和水。模型复制过程中，观察各模型小鼠的症状、饮水量、饮食量、体质量、肛温[17-19]。

2.3 模型成功标准

①一般状况观察：小鼠精神不振，嗜睡懒惰，反应迟钝，饮食量和饮水量减少，体质量减轻，肛温升高，小便黄，大便稀溏[19-21]。②胃黏膜组织快速尿素酶试验阳性。③HE染色法观察胃黏膜组织呈炎性改变。

2.4 标本采集

脱颈处死后即迅速取胃组织，首先将小鼠以仰卧的体位固定在鼠板上，然后快速用相关实验器械将全胃组织取出。摘下全胃，贮存于-80 ℃冰箱中。

2.5 各模型组建立的HAG脾胃湿热证小鼠模型相关指标检测

2.5.1 胃黏膜组织病理形态及炎症程度

第一步将制好的切片放置在60 ℃的条件下烘烤12 h；第二步切片脱蜡至水；第三步苏木素染1 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝后，再用伊红染1 min，蒸馏水冲洗；最后脱水后取出置于二甲苯中2次，每次放置10 min，然后用中性树胶封片后在显微镜下观察。

2.5.2 胃黏膜细胞凋亡情况：TUNEL法检测胃黏膜细胞凋亡率

60 ℃条件下烘片60 min，脱蜡至水；浸入3%H2O2溶液中，室温条件下(15～25 ℃)12 min后用PBS漂洗3次；热修复抗原处理；每个样本加50 μL内源性亲和素封闭A液，孵育20 min，然后弃液用PBS漂洗3次，依上方法再加入内源性亲和素封闭B液；各样本加入50 μL预先配置好的TdT酶反应液，放置在37 ℃避光的条件下60 min，反应后PBS漂洗3次，漂洗过程中需要避光处理，漂洗完后各样本上加入50 μL标记工作液，放置在37 ℃避光的条件下30 min，反应后漂洗3次漂洗过程中注意避光；最后DAB显色，各样本上加入50 μLDAB工作液，反应30 s～5 min；显色后的样本片用PBS漂洗3次，然后苏木素复染，复染完成后冲洗干净并进行分化，分化后立即冲洗干净并脱水后用显微镜观察。

2.5.3 Western-blot检测PTEN、PI3K、p-Akt、Akt、FoxO3a

Western-blot检测法：制备样品，将经预处理后的0.025 g组织，放置至200 μL RIPA裂解液中并进行反复研磨处理，冰上，蛋白裂解10 min，然后离心15 min，经上处理后即检测蛋白浓度。电泳，向10%分离胶中添加 TEMED后摇匀并灌胶，然后使其充分凝固；依照以上方法再处理4.8%的浓缩胶；得出蛋白定量的结果后即开始电泳。转膜，分别切胶Foxo3a(72-97KD)，P-AKT(60KD)，PI3K(85KD)，PTEN(55KD)，β-actin(42KD)；准备好符合条件的滤纸和NC膜；滤纸，膜，胶按要求顺序放好后，盖上仪器，接通电源，转膜300 mA，PTEN、P-AKT约75 min，PI3K、Foxo3a约100 min， β-actin 约1 h；上述步骤完成后，先用1×TBST中清洗1次，然后用丽春红染膜后，再用1×TBST将丽春红洗净。将膜放入用1×TBST制好的5%脱脂奶粉中，放置在室温下1.5 h。孵育一抗，1×TBST稀释一抗至一定比例，然后孵育膜与一抗，在4 ℃放置一夜。孵育结束，1×TBST洗3次，每次15 min。孵育二抗，用1×TBST稀释二抗(Proteintech)，鼠抗(M)稀释比例1∶5 000，兔抗(R)比例1∶6 000，孵育二抗与膜90 min；孵育结束，1×TBST洗3次，每次15 min。抗体孵育完成后最后借助相关仪液和设备进行显色和曝光。

2.5.4 RT-PCR法检测PTEN、PI3K、p-Akt、Akt、FoxO3a

RT-PCR检测法：RNA的提取，依据相关试剂操作步骤及实验仪器提取组织的RNA。RNA反转录，以mRNA为模板，逆转录cDNA；轻轻晃动充分摇混均匀，然后用离心机离心并取最下层的溶液；42 ℃孵育30～50 min，85 ℃孵育5 min。孵育过程完成后即短时间离心机离心，离心后用冰进行冷却；其处理形成的产物可直接进行PCR反应，或保存在-20 ℃条件下。进行PCR反应，选用SYBR法，反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却，β-actin作为内参，在NCB上搜索目的基因的序列，qRT-PCR各样本各指标3个孔，总共30 μL体系，每孔10 μL，定量PCR扩增程序：依次95 ℃ 10 min， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 50 s，共40个循环。以相对定量比较actin基因与目标基因的Ct值，得出所测目标基因相对表达量。相对mRNA表达=2-△Ct×100%，△Ct值=靶基因Ct值-actin Ct值。通过PCR仪配套软件计算结果。

2.6 统计学处理

所有数据均输入计算机，用SPSS 22.0 Windows软件进行处理。各检测指标统计数据以均数±标准差表示，检测符合正态分布后选用方差分析法进行比较，方差齐时选择LSD法，方差不齐时则选择Tamhane法，设置P<0.05为有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各实验组胃黏膜组织病理形态及炎症程度情况

各模型表现为不同程度的倦怠、纳呆、便溏、饮食水量减少，肛温不同程度升高等表现，然后每组随机取2只小鼠(1雌1雄)综合评价是否造模成功。取胃黏膜组织进行快速尿素酶实验(试剂由黄变红为阳性)，正常对照组结果为阴性，各模型组均为阳性。HE染色法显微镜下观察到模型组胃黏膜组织存在炎性改变。结合模型组症状表现，胃黏膜组织快速尿素酶试验阳性以及HE染色观察结果，与脾胃湿热证模型相符，说明造模成功。

显微镜下，正常对照组胃黏膜上皮细胞排列整齐，呈单柱状，固有层内有密集排列的腺体，极少部位可见少量淋巴细胞。模型组胃黏膜炎症程度重，其中以复合病因组最为明显，其次分别为内湿HP组、外湿HP组、单纯HP组。胃黏膜炎症程度越重，胃黏膜上皮细胞排列越紊乱，固有层内淋巴细胞，嗜酸性粒细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润越多，甚至炎症细胞可侵及黏膜下层。见图1。

图1 各实验组胃黏膜组织病理形态及炎症 HE染色(×400)

3.2 胃黏膜细胞凋亡情况及FoxO信号通路相关物质蛋白表达与基因含量情况

3.2.1 各实验组胃黏膜细胞凋亡情况

显微镜下阳性染色为核染成棕(黄)色或褐色染色，正常组图片示阳性率较低，提示细胞凋亡率较低；模型组图片示阳性率较高，其中以复合病因组阳性率最高，其次分别为内湿HP组、外湿HP组，且均高于单纯HP组。由此可得出HAG脾胃湿热模型细胞凋亡增多，且以复合病因组细胞凋亡率最高。结果见图2。

图2 各实验组胃黏膜细胞凋亡(×400)

3.2.2 各实验组 FoxO信号通路相关物质蛋白表达结果

PTEN、FoxO3a表达情况：单纯HP组与正常对照组对比，PTEN、FoxO3a表达水平无显著差异，无统计学意义(P>0.05)；余模型组与正常对照组对比，PTEN、FoxO3a表达水平升高，且统计有显著差异(P<0.01)，其中以复合病因组升高更为显著。复合病因组分别与单纯HP组、内湿HP组、外湿HP组对比，PTEN表达水平升高最多，且比较均有显著性差异(P<0.01)。复合病因组与单纯HP组，FoxO3a表达水平升高，比较有显著差异(P<0.01)，而与内湿HP组、外湿HP组对比，FoxO3a表达水平无显著差异(P>0.05)。结果见表1，图3。

表1 western blot法检测胃黏膜组织PTEN、FoxO3a蛋白表达情况

PI3K、p-Akt表达情况：与正常对照组对比，各模型组PI3K、p-Akt表达水平均下降，比较有显著性差异(P<0.01)，以复合病因组下降最为显著。复合病因组分别于内湿HP组、外湿HP组、单纯HP组比较，PI3K、p-Akt表达水平降低最多，其中与内湿组比较有差异(P<0.05)，与外湿HP组、单纯HP组比较有显著差异(P<0.01)。结果见表2,图3。

表2 western blot法检测胃黏膜组织PI3K、p-Akt蛋白表达情况

图3 western blot法检测胃黏膜组织PI3K、p-Akt蛋白表达情况

3.2.3 FoxO信号通路相关物质基因含量比较结果

PTEN、FoxO3a含量：各模型组与正常对照组对比，PTEN、FoxO3a含量升高，比较有显著差异，有统计学意义(P<0.01)，其中以复合病因组升高更为显著。复合病因组分别与单纯HP组、内湿HP组、外湿HP组对比，复合病因组PTEN、FoxO3a含量升高最多，且比较均有显著差异(P<0.01)。结果见表3。

PI3K、Akt含量：与正常对照组对比，各模型组PI3K、Akt含量降低，且差异有显著统计学意义(P<0.01)，其中以复合病因组降低更为显著。复合病因组分别与单纯HP组、内湿HP组、外湿HP组对比，复合病因组PI3K、Akt含量降低最多，且比较均有显著差异(P<0.01)。结果见表4。

表3 RT-PCR法检测胃黏膜组织PTEN、FoxO3a表达情况

表4 RT-PCR法检测胃黏膜组织PI3K、Akt表达情况

4 讨论

4.1 脾胃湿热、HP感染与胃黏膜细胞凋亡之间的关联性

HP感染在脾胃湿热证形成、发展过程中发挥很大作用，脾胃湿热证与HP感染存在很大关联性。脾胃湿热与HP两者相互影响，湿热环境为HP的生长繁殖提供有利条件，而HP持续感染可进一步导致脾胃湿热证症状的加重。HP可以通过多种不同的机制来诱导胃黏膜细胞凋亡。HP产生的各种细菌毒性因子，如脂多糖、空泡化细胞毒素(Vac A)、γ谷氨酰胺转肽酶等可以直接诱导胃黏膜细胞凋亡。除了HP产生的细菌毒性因子诱导胃黏膜细胞凋亡，还可以通过HP相关的宿主炎性反应来诱导胃黏膜细胞凋亡[22-23]。

在临床观察和实验研究基础上[13-14]，发现在各种中医证型中，脾胃湿热证胃黏膜细胞凋亡最为明显(胃黏膜炎症程度重，促细胞凋亡的相关蛋白水平呈过度表达)。实验研究发现脾胃湿热证模型组胃黏膜炎症程度、凋亡蛋白Fas、p53表达水平、胃黏膜细胞凋亡指数明显高于正常对照组。并且用具有清热祛湿法功效的中药方剂干预后，脾胃湿热证动物模型的炎症程度，Fas、p53的表达水平以及凋亡细胞指数均明显降低。

本实验检测各模型组胃黏膜细胞凋亡率呈不同程度升高，胃黏膜炎症程度呈不同程度变化，凋亡率高低变化与炎症程度变化相一致，其结果与前期研究结果相符，证明了HAG脾胃湿热证小鼠模型存在胃黏膜细胞凋亡增多。

4.2 PTEN/PI3K/Akt/FoxO信号通路对细胞凋亡的调控

细胞凋亡中Fox转录因子的O亚家族(subfamily O of fork head transcription factors,FoxO)发挥着很重要的作用。FoxO的合成场所是细胞质，在细胞质中合成后的FoxO可直接激活其NLS模体与importin(IMP)结合，从而进入细胞核中，DBD(DNA结合模体)与DNA结合诱导细胞的死亡；如果FoxO被其他物质磷酸化就无法进入细胞核中，从而失去对细胞凋亡的调控，细胞存活[24]。在人体许许多多复杂的信号通路中，PTEN/PI3K/Akt/FoxO信号通路对细胞的凋亡有着重要的调控作用[25]。

脂激酶家族磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)的作用是将磷脂酰肌醇磷酸化。PI3K在细胞膜内被激活后，将磷脂酰肌醇-2-磷酸(PIP2)转变为磷脂酰肌醇-3-磷酸(PIP3)，而PIP3的作用是与Akt的N端PH结构域结合，PIP3与Akt相结合后，Akt就可以从细胞质中转移到细胞膜上，转移到细胞膜上的Akt将与3-磷酸肌醇依赖性蛋白(3-phosphoinositid-dependent protein kinase-1, PDK1)相结合，从而进一步使下游的许多底物活化并磷酸化，从而发挥相应作用[26]。

第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, PTEN)的主要作用是抑制细胞生长、促进细胞凋亡、参与细胞周期调控[27]。研究表明PTEN具有拮抗PI3K的作用，PI3K被拮抗后导致PIP3量减少，从而促进细胞凋亡，所以PTEN是通过抑制PI3K表达，下调PIP3的水平来发挥对细胞凋亡起调控作用的[28]。叉头转录因子O亚家族FoxOs是PTEN/PI3K/Akt/FoxO信号通路中重要的转录调控因子[29]，在细胞凋亡过程中起着重要作用。当PI3K/Akt信号途径在机体内环境各种因子的刺激下被激活时将FoxO3a磷酸化。被磷酸化的FoxO3a失去了转录活性，然后将从细胞核内排出，最终在细胞质中被降解，从而无法调控细胞凋亡。

5 结论

综上所述，各模型组胃黏膜炎症程度重，细胞凋亡率高，其中复合病因模型组胃黏膜炎症程度以及细胞凋亡率最高，其与本课题组前期研究相符。在各模型组中，复合病因模型组其PTEN、FoxO3a蛋白表达检测和基因含量检测值最大，PI3K、Akt蛋白表达检测和基因含量检测值最小，结合各实验组综合比较，从而发现炎症程度及细胞凋亡率与PTEN、FoxO3a呈正相关变化，与PI3K、Akt呈负相关变化。依据PTEN/PI3K/Akt/FoxO信号通路调控细胞凋亡的机制，其细胞凋亡程度情况与其信号通路各因子变化情况相符，由此我们得知HP相关性胃炎脾胃湿热证胃黏膜细胞凋亡的机制与PTEN/PI3K/Akt/FoxO信号通路有关，可能是激活其通路来对细胞凋亡进行调控，从而为中医辨证选方用药及中医药防治HP相关性胃炎提供更多理论依据。