雷 敏，刘 斌，阮梅林，罗 云

（华中科技大学 生命科学研究共享平台，湖北 武汉 430074）

蛋白质分子量是蛋白的重要特征参数，同时是研究蛋白均一性、聚集状态和蛋白间相互作用等特征参数的基础。因此，准确有效地测定蛋白质分子量非常关键[1-2]。传统测定蛋白质分子量的方法主要包括凝胶电泳法[3]、高效凝胶过滤色谱-多角度激光光散射法[4]、电喷雾离子化质谱法[5]以及基质辅助激光解吸电离质谱法[6-7]。其中凝胶电泳法和凝胶色谱法操作复杂，对样品的需求量高，受样品的形状和尺寸影响较大，结果准确度低[8]。电喷雾离子化质谱法和基质辅助激光解吸电离质谱法是近几年发展迅速的生物大分子测定技术，也是目前测定蛋白质分子量的主要方法[2]。近年来，由于分析超速离心法在测定蛋白质分子量的同时，可从相同数据组中同时分析出待测蛋白的均一性、聚集状态、化学计量比和分子构象等多项特征参数，且该方法具有样品需求量少、无需标准品、无破坏性和普适性高等诸多优势，受到越来越多的研究者青睐[8-19]。

已有的文献报道主要基于利用该方法测定蛋白质分子量或其特征参数，但对于检测过程中样品的初始浓度、离心转速等实验条件的改变是否会对测定结果产生影响并未提及。而研究各项实验条件的影响并筛选出合适的参数，对于准确测定蛋白质分子量及其他特征参数具有重要的意义。因此，本文以牛血清蛋白（albumin bovine serum，BSA）和人血清免疫球蛋白（human serum immunoglobulin G，IgG）作为研究对象，在分析超速离心-沉降速率（sedimentation velocity of analytical ultracentrifugation，AUC-SV）模式下，探究了样品初始浓度、离心转速和样品上样体积等实验条件对测定结果的影响。在优化的实验条件下，建立了 AUC-SV 测定蛋白质分子量的方法，同时可为AUC-SV 初学者提供技术指导。

1 实验部分

1.1 仪器

分析型超速离心机 ProteomeLab XL-I（美国Beckman 公司），型号为An-60 Ti 的4 孔转头，使用2-channel 树脂中心件和蓝宝石窗口组装样品池；紫外超微量分光光度计NanoDrop2000（Thermo 公司）；基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱MALDI-TOF/TOF MS 5800（美国AB SCIEX 公司）。

1.2 试剂

BSA（≥98%）标准品购自Biofroxx 公司；IgG（≥95%）标准品购自Sigma 公司；Tris(hydroxymethyl)aminomethane（试剂纯，≥99%）购自Sigma 公司；磷酸盐溶液（phosphate buffered solution, PBS）购自北京Biosharp 公司；NaCl（分析纯）购自上海沪试公司。

1.3 AUC-SV

分别在分析型超速离心机中注入400 μL pH 8.0 PBS 和380 μL 样品溶液。样品浓度采用紫外超微量分光光度计进行测定，记录样品在280 nm 处的吸光度A280。设置紫外检测波长为280 nm，扫描频率为6 min/次，在4 ℃及40 000 r/min 的条件下离心，待样品全部离心至池底时停止扫描和离心。使用SEDFIT软件[20]对数据进行拟合分析后可得蛋白质分子量。

1.4 实验条件的优化

实验条件的优化按照样品初始浓度、离心转速、离心时间、离心温度、样品上样体积和缓冲液体系的顺序进行，每次只改变单一实验条件，已优化的实验条件直接应用到后续的分析中，待优化的实验条件则参考节1.3。

1.5 质谱法测定蛋白质分子量

使用基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱，在Linear High Mass Positive 模式下，以芥子酸为基质，测定未知蛋白质分子量。

2 结果与讨论

2.1 样品初始浓度的选择

样品性质不同及仪器性能差异均可能影响到样品适合的初始浓度。首先测定了BSA 和IgG 初始浓度A280分别为0.1、0.4、0.7、1.0、1.2 Abs 时的分子量，结果如表1 所示。从表1 可以看出，在上述浓度范围内，拟合得到的BSA 和IgG 分子量均与标准分子量接近，相对误差在±5%以内。但通过对拟合得到的峰形进行分析，发现BSA 在A280为0.1 Abs 时，峰形延展较宽，拟合得到的分子量分布较实际范围宽。而A280为1.2 Abs 时，两者的紫外扫描误差达到±0.05 Abs，超过仪器允许范围(±0.02 Abs)。因此，在进行未知蛋白质分子量检测时，建议调节样品初始浓度A280在0.4～1.0 Abs 之间。

表1 不同样品初始浓度下的分子量拟合结果

2.2 离心转速的选择

树脂中心件能承受的最高转速为40 000 r/min，因此比较了转速在40 000、30 000、20 000 r/min 下的拟合结果，如表2 所示。在相同的离心转速下，分子量较大的IgG 离心沉底的时间较短。在20 000 r/min时，样品经20 h 的长时间离心后仍然未能沉底。3 个转速条件下拟合得到的分子量与标准分子量接近，相对误差均在±2%以内。这说明离心转速对拟合结果影响不明显，但转速越低，离心时间要求越长，因此选择40 000 r/min 可快速高效获得蛋白质分子量。

2.3 离心时间的选择

分析节2.2 所述（40 000 r/min）不同离心时间的数据，结果如表3 所示。BSA 离心到池底需要10 h，IgG 需要 6 h，拟合得到的分子量分别为 68.0 和150 kDa，与标准分子量一致。当离心时间较短（3～6 h）时，未离心到池底的数据经拟合得到的分子量与标准分子量也较为接近，相对误差在±3%以内。IgG离心时间9 h 及以上，分子量相对误差逐渐增大，由-5.33%增加到-7.33%，这是由于样品沉底后，所采集到的数据浓度变化不明显，有效数据减少，从而导致拟合误差增大。因此，当样品离心到池底时即可停止离心，同时在进行数据拟合时应注意选取拟合区间，避免导入重复的沉底数据。

表2 不同离心转速下的分子量拟合结果

表3 不同离心时间下的分子量拟合结果

2.4 离心温度的选择

BSA 和IgG 在溶液状态下稳定存在的最适温度均为4 ℃，而SEDFIT 软件拟合参数默认温度为20 ℃。因此对比了在4、10、20 ℃条件下的拟合结果，如表4所示。由表4 可知，4 ℃条件下拟合得到的分子量与标准分子量一致，随着温度升高，相对误差明显增大。而根据拟合得到的峰形及峰的数量来看，BSA 和IgG在3 个温度条件下均未出现明显分解或聚集现象，误差增大的原因可能是随着温度升高，溶液的黏度降低，样品沉降系数变小，从而分子量测定结果偏低[21]。此外，可推断在此实验条件下，SEDFIT 软件拟合时对温度的要求并不严苛，因此对于未知蛋白质，可选择在其稳定的温度下进行离心即可。

表4 不同离心温度下的分子量拟合结果

2.5 样品上样体积的选择

对上样体积分别为100、200、380 μL 的实验结果进行了比较，如表5 所示。随着上样体积的减少，BSA 和IgG 拟合得到的分子量与标准分子量之间的相对误差都变大，且IgG 的相对误差高于10%。这是由于样品上样体积减小，样品池的有效扫描半径和数据拟合区间缩短，导致拟合的有效数据量减少。此外，离心过程中IgG 的沉降速度更快，IgG 的有效拟合数据较BSA 少，导致拟合得到的IgG 分子量相对误差较BSA 更大。因此建议对12mm 2-channel 树脂中心件的上样体积为380 μL。

表5 不同上样体积的分子量拟合结果

2.6 缓冲体系的选择

比较了BSA 和IgG 在水、PBS 和150mmol/L NaCl-50mmol/L Tris 混合溶液3 种溶剂体系的实验结果，如表6 所示。BSA 和IgG 在3 种溶液中均能稳定存在，测定结果与标准分子量接近。但已有文献报道，测量带电体系时需要加入小分子盐以屏蔽溶质分子间静电相互作用，以消除静电相互作用对分子在溶液中运动产生的影响[22]。如对于多数等电点在4～5 之间的蛋白质，建议采用pH 范围在7～9 之间的缓冲溶液。

表6 样品在不同缓冲体系中的分子量拟合结果

2.7 未知蛋白质样品分析

在上述优化的实验条件下，以PBS 为缓冲体系，测定未知蛋白质的分子量，并与质谱测定结果进行比较，如图1 所示，表示蛋白质浓度c 分布与沉降系数s 分布的对应关系。AUC-SV 法和MALDI-TOF/TOF质谱法测得该蛋白质分子量分别为39.9 kDa（图1(a)）和40.0 kDa（图1(b)），两者测定结果一致，说明该方法可用于测定其他蛋白质的分子量。

图1 未知蛋白质分子量测定结果

3 结论

本文通过对AUC-SV 实验条件研究发现：离心转速在20 000～40 000 r/min 对测定结果无明显影响，但离心转速越大，离心时间越短，建议优先选择40 000 r/min，以快速获得实验结果。样品初始浓度、离心时间、离心温度和缓冲液体系的适宜范围则较宽，样品上样体积对测定结果的影响显著，建议对于12mm 2-channel 树脂中心件的上样体积为380 μL。在优化的实验条件下，测得未知蛋白质的分子量为39.9 kDa，与质谱法测定结果（40.0 kDa）一致。该方法具有适宜条件范围宽、非破坏性、无需标准品和普适性高等优点，可广泛应用于未知蛋白质分子量的测定，其主要缺点则是对样品的纯度要求较高[23]，否则测定结果可能会受到杂质干扰。此外，本文详细探讨了各项实验条件对测定结果的影响，可供AUC-SV 初学者学习借鉴。