王宏刚，魏 远，陈成彬，王春国，宋文芹，白艳玲，黄桂安,2

（1.南开大学 生物国家级实验教学示范中心，天津 300071；2.青岛农业大学 生命科学学院，山东 青岛 266109）

减数分裂是一种发生在真核生物有性生殖细胞形成过中的一种特殊的有丝分裂形式，是生物遗传和变异的细胞学基础[1-2]。同源染色体联会与重组是发生在减数分裂前期I 的重要生理活动。近年来，对同源染色体联会与重组的研究已经成为减数分裂领域的研究热点之一[3-4]。随着教学改革的深入，各个高校越来越重视科研前沿技术在实验教学中的应用[5-6]。通过在实验课程中开设减数分裂同源染色体联会与重组观察实验，可以帮助学生对同源染色体联会与重组过程中联会复合体和重组节形成直观的认识，让他们更加了解同源染色体联会与重组的过程。教学过程中，首先制作小鼠精母细胞的染色体展片，然后通过免疫荧光双标技术对联会复合体蛋白SCP1 和SCP3 的荧光标记，最后在荧光显微镜下观察减数分裂前期I 各时期联会复合体的特点。另外，使用MLH1（MutL homologue 1）的单克隆抗体对联会复合体上的重组节进行标记，可以对减数分裂中的同源重组现象进行观察。

1 实验仪器与器材

1.1 实验仪器

正置荧光显微镜、离心机。

1.2 实验器材

染色缸、湿盒、封口膜、1.5 mL 离心管、剪刀、镊子、一次性培养皿、移液器。

2 实验材料与试剂

2.1 实验材料

成年雄性小鼠。

2.2 实验试剂

抗小鼠SCP3 抗体（山羊来源）、抗小鼠SCP1 抗体（兔来源）、抗小鼠MLH1 抗体（兔来源）、FITC标记的抗山羊抗体、Rhodamine 标记的抗兔抗体、FITC标记的抗兔抗体、Rhodamine 标记的抗山羊抗体、PBS-T（在PBS 中加入终浓度为0.1%的Trion X 100）、5% BSA（称取0.5 g BSA 溶于10 mL PBS-T 中）、PBS、100mmol/L 蔗糖溶液、1% PFA、0.4% Photoflo、封片剂、DAPI、70%乙醇。

3 实验方法

3.1 减数分裂染色体展片的制备

断颈法处死小鼠，用70%乙醇对小鼠进行消毒处理。取出小鼠的睾丸放入盛有PBS 的一次性培养皿中。用镊子将睾丸表面的白膜除去，拉出长段的曲细精管。取长约5 cm的曲细精管，放入盛有200 μL PBS的1.5 mL离心管中，用剪刀将曲细精管剪碎。补加PBS 至1 mL，然后用移液器吹打多次，使细胞尽量从曲细精管中游离出来。室温静置1 min，取上清。200 g 离心3 min，PBS 漂洗细胞2 次。细胞沉淀用100～200 μL 的100mmol/L蔗糖溶液重悬，制成细胞悬液。用1% PFA 溶液浸润载玻片，取40 μL 细胞悬液滴到载玻片中央，湿盒中放置3 h。取出载玻片充分晾干，用0.4% Photoflo 清洗2 min，晾干后放入载玻片盒，-20 ℃保存备用。

3.2 小鼠SCP3 蛋白和SCP1 蛋白的免疫荧光标记

取出制备好的减数分裂染色体展片标本，使用PBS-T 洗10 min。滴加50 μL 5% BSA 至一块比载玻片稍小封口膜上，将染色体展片标本倒扣到封口膜上，放入湿盒处理0.5～1 h。去掉封口膜，去除封闭液。将1∶100 稀释的抗小鼠SCP3 抗体（山羊来源）和抗小鼠SCP1 抗体（兔来源）等体积混合，取20 μL 抗体混合液滴到封口膜上，将载玻片反扣到封口膜上，湿盒中室温孵育1 h。孵育完成后，用PBS-T 漂洗载玻片3 次，每次10 min。将1∶100 稀释的FITC-抗山羊二抗和Rhodamine-抗兔二抗等体积混合，取20 μL 荧光二抗混合液滴加到新的封口膜上，载玻片反扣到封口膜上，湿盒中室温避光孵育0.5～1 h。孵育完成后，用PBS-T 漂洗载玻片3 次，每次10 min。晾干后，取15 μL 封片剂至载玻片上，盖上盖玻片，用指甲油封住边缘。正置荧光显微镜下，使用绿色荧光模块对SCP3 进行观察和拍照，使用红色荧光模块SCP1 进行观察和拍照。

3.3 小鼠SCP3 蛋白和MLH1 的免疫荧光标记

实验方法同节3.2，一抗使用抗小鼠SCP3 抗体（山羊来源）和抗小鼠MLH1 抗体（兔来源），二抗使用Rhodamine 标记的抗山羊抗体和FITC 标记的抗兔抗体。使用绿色荧光模块对MLH1 进行观察和拍照，使用红色荧光模块对SCP3 进行观察和拍照。

4 实验结果

4.1 小鼠SCP3 蛋白和SCP1 蛋白的免疫荧光标记

根据减数分裂前期I 各阶段染色体联会特点，在荧光显微镜下寻找细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期的细胞，如图1 所示。

4.2 小鼠SCP3 蛋白和MLH1 的免疫荧光标记

染色体的同源重组现象发生在粗线期，在显微镜下寻找粗线期的细胞进行观察，如图2 所示。

5 讨论

5.1 同源染色体联会与DNA 同源重组的重要性

图1 减数分裂前期I 各阶段联会复合体的形态（100×）

图2 减数分裂前期I 粗线期联会复合体和重组节的形态（100×）

同源染色体联会与重组是发生在减数分裂前期I的重要生理活动，也是遗传学教学中的重要知识点。联会复合体能够为联会的发生和同源染色体交叉提供框架，是同源染色体联会和基因重组的关键性结构[7]。联会复合体的异常将导致联会不能正常进行，不能产生正常的配子。围绕联会复合体形态进行的研究已经广泛应用于精子发育异常、雄性不育症机理研究和临床诊断领域[8-9]。这些知识与生命科学类及相关专业本科生未来的学习和科研紧密相关。目前，在大部分高校中，该知识点的教学仅在理论课层面展开，并没有实验课程与之匹配。在实验课程中开设相关的实验项目，让学生直观地观察到联会复合体和重组节形态特点，可以帮助他们了解和掌握同源染色体联会和DNA同源重组。

5.2 实验的注意事项

染色体展片是本实验的一个难点，为了获得较多的精母细胞，操作时就要尽量将曲细精管剪碎。此外，展片需要一定的时间，时间越长细胞的分散度越好，同时要注意保湿，防止细胞悬液蒸发。实验采用了免疫荧光双标的方法，2 种抗体混合的比例需要通过预实验来确定，避免出现2 种荧光亮度差距较大的问题。

5.3 教学的组织安排

减数分裂同源染色体联会与重组观察实验主要包括3 部分内容：“减数分裂染色体展片的制备”需要5～6 学时，“SCP3 和SCP1 的免疫荧光标记”需要4～5学时，“SCP3 蛋白和MLH1 的免疫荧光标记”需要4～5学时。在组织教学时，这3 部分可以作为3 个独立的实验项目开设，也可以将“减数分裂染色体展片的制备”同“SCP3 和SCP1 免疫荧光标记”或“SCP3 和MLH1 免疫荧光标记”进行组合，作为一个8～10 学时的实验项目，还可以将3 部分内容组成一个14～16 学时的综合性实验。

6 结语

在理工类专业创新性科研人才培养的过程中，实验教学发挥着非常重要的作用。通过实验教学的改革来助力创新性科研人才的培养也越来越受到大家的认可[10-12]。将与科研前沿紧密相关的知识转化为实验项目，使这些实验教学的教学内容更加贴近科研实践，提高学生对科学研究的兴趣，为创新性人才培养模式探索提供思路。