翁亚烦，李志勋，邱丙珊，杨圳超，刘 平，信吉阁，富国文，赵桂英*

(云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明650201)

小型猪不仅具有肉嫩味美、皮薄肉香、抗逆性强、耐粗饲、体小早熟等诸多优点，部分器官生理结构及系统与人类还极其相似，脏器重量亦与人类相接近，是较为理想的研究人类相关疾病的模型动物[1]。云南小型猪资源丰富，拥有滇南小耳猪、迪庆藏猪、明光小耳猪等小型猪种资源。滇南小耳猪分布于云南南部的热带和亚热带地区，耐高温潮湿，是我国著名的地方猪种之一[2]。迪庆藏猪分布于迪庆州中北部高寒山区和半山区，属于高原地带；明光小耳猪分布于腾冲县明光乡、曲石乡、界头乡等地，在中缅边境交通闭塞山区也有分布[3]。研究云南六个小型猪之间的亲缘关系，为其遗传资源的有效保护和开发利用提供参考。自1962年Nass等[4]发现了线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)的存在后，许多学者对核外遗传系统开展了大量的研究工作。线粒体DNA作为动物体内一种长期稳定存在的核外遗传物质，具有重组率低、替换速度快、严格母系遗传、结构稳定等特点被广泛用于动物起源进化和遗传多样性等研究[5-6]。D-loop基因是mt DNA的控制区，在整个mt DNA序列中变异最大，进化速度快。Touma[7]从mt DNA控制区研究冲绳本地阿古猪，表明阿古猪的祖先起源于亚洲大陆。到目前为止，关于云南省内小型猪亲缘关系的研究报道甚少。本试验利用线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)D-loop高变区为标记，研究云南四个地区的滇南小耳猪(版纳小耳猪、盈江小耳猪、金平小耳猪、芒市小耳猪)、迪庆藏猪、明光小耳猪之间的亲缘关系，以期从分子水平揭示云南六个小型猪的遗传多样性及其分布规律。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采集滇南小耳猪、明光小耳猪和迪庆藏猪耳组织共60份，其中滇南小耳猪包括版纳小耳猪(BS)、盈江小耳猪(YJ)、金平小耳猪(JP)、芒市小耳猪(MS)，各10份，置于1.5 mL离心管中，加入75%酒精，-20 ℃贮藏，备用。

1.2 试验方法

2.2.1 猪全基因组DNA的提取 采用常规酚/氯仿抽提方法提取耳组织DNA。采用常规酚/氯仿抽提方法提取猪耳组织DNA。取约10 g的6个小型猪耳组织置于1.5 mL规格的离心管中剪碎，待酒精挥发后每管分别加入蛋白酶K(10 mg/mL)溶液和DNA组织提取液，过夜消化。消化完全后，加入Tris饱和酚，离心取上清液。将酚：氯仿：异戊醇混合液(25∶24∶1)加入吸取的上清液中，进行抽提。加入氯仿：异戊醇混合液(24：1)进行第二次抽提，重复该步骤一次。加入无水乙醇，沉淀DNA后倒掉无水乙醇，加入70%的乙醇洗涤DNA。最后加入TE缓冲液以溶解DNA，放入37 ℃水浴锅中助溶过夜，然后在68 ℃条件下水浴约25 min灭活，瞬时离心，保存在-20 ℃环境下长期贮存备用。

1.2.2 目的片段扩增与测序 根据发表在GenBank公共数据库提供的中国地方猪的线粒体DNA的全系列基因组，采用Premer5.0软件设计引物，上游引物为5'-AGACTAACTCCGCCATCAG-3'，下游引物为5'-CGCGGATACTTGCATGTGT-3'，引物由擎科生物工程技术有限公司合成。

PCR扩增体系(25 μL)为：DNA模板1.5 μL，1.1x T3 Super PCR Mix21.5 μL，上下游引物各1 μL。PCR条件：94 ℃，预变性3 min；94 ℃变性40 s，55.5 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共计30个循环；循环结束后，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物经1.0%浓度琼脂糖凝胶电泳检测后，合格的样品送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序。

1.3 数据处理

利用软件Chromas检查测序结果，运用软件DNAMAN进行序列拼接、比对，使用MEGA6的NJ法绘制进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

通过PCR扩增的mtDNA D-loop序列，以DNA Marker(DL2000)作为参照，确定PCR产物的片段大小。引物PCR扩增片段与预期目的片段大小一致，条带单一，同时条带无二聚体存在，明亮清晰，整齐，无拖带，结果如图1所示。

2.2 mtDNA D-loop区碱基含量及其比例

六个猪种(A+T)/(G+C)的比分别是：1.33、1.32、1.35、1.31、1.35、1.56。所检测猪群猪线粒体DNA D-loop区内(G+C)含量平均为42.3%，低于(A+T)含量，这与脊椎动物线粒体DNA D-loop区碱基组成的特点相符合，结果见表1。

2.3 mtDNA D-loop区部分位点碱基比较

六个小型猪的mtDNA D-loop区碱基序列经MEGA比对、剪接，分析序列共1 030 bp，共有9个碱基位点存在差异，结果见表2。

表1 碱基含量及其比例Table 1 Base content and its proportion

表2 6个小型猪 mt DNA D-loop区部分位点碱基比较Table 2 Base comparison of partial sites in mt DNA D-loop region of six mini-pigs

2.4 遗传距离分析

对六个小型猪猪群进行两两之间比较，计算进化距离，结果见表3。迪庆藏猪与版纳小耳猪的遗传距离最远；芒市小耳猪与盈江小耳猪、版纳小耳猪与金平小耳猪遗传距离最近；迪庆藏猪与明光小耳猪、金平小耳猪与明光小耳猪遗传距离中等。

2.5 构建进化树

引用梅山猪作为外系，利用MEGA邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统树结果如图2所示。梅山猪作为单独的一支，与云南四个地区的滇南小耳猪(版纳小耳猪、盈江小耳猪、金平小耳猪、芒市小耳猪)、迪庆藏猪、明光小耳猪无杂交。6个小型猪群中，版纳小耳猪(BN)与迪庆藏猪(DQ)遗传距离最远；版纳小耳猪(BN)、盈江小耳猪(YJ)、金平小耳猪(JP)与芒市小耳猪(MS)属于同一个大的分支，其中，盈江小耳猪(YJ)与芒市小耳猪(MS)属于同一个小的分支，版纳小耳猪(BN)与金平小耳猪(JP)又属于同一个小支；明光小耳猪(MG)与迪庆藏猪(DQ)属于另一个大的分支。

表3 6个小型猪遗传距离比较Table 3 Comparison of genetic distances of six small pigs

3 讨 论

3.1 mtDNA D-loop区遗传多样性

mtDNA结构简单、稳定，遵守母性遗传方式，在世代传递过程中没有重组，因而对mtDNA的研究可用于探讨猪种的起源进化及亲缘关系分析[8]。本研究对云南六个小型猪群(版纳小耳猪、盈江小耳猪、明光小耳猪、金平小耳猪、迪庆藏猪、芒市小耳猪)线粒体DNA D-loop区序列进行测序，DNA D-loop区内(G+C)含量平均为42.3%，低于(A+T)含量，表现出明显的AT偏移性，这与脊椎动物线粒体DNA D-loop区碱基组成的特点相符合。猪线粒体DNA D-loop区除了突变现象外，还存在少数碱基缺失或插入及不同数量的串联重复序列，因而长度可变。本研究测序结果显示，6个猪群线粒体DNA D-loop区序列长度在1 036～1 292 bp之间，且个别个体存在插入或者缺失现象。

本研究的依据是序列从一个共同祖先出现分化。由于突变的存在，而且其中一小部分突变会在群体进化中被固定下来，但这些位点是随机突变的，一些位点有可能突变了2次，比如从A突变为G，然后再从G又突变为T，而这时我们仅能观测到1次变化。同样，如果一个位点从A突变为G又突变为A，共计突变了两次，但我们却观测不到这样的突变。像这样同一位点上出现多次替代，而样本含量不够时，很有可能会导致低估了在分支上出现的突变数量，这是本实验有待改进的地方。

4.2 6个小型猪的亲缘关系

种间遗传距离表明不同种群之间的亲缘关系远近[9]。本研究结果表明6个小型猪猪群中，明光小耳猪(MG)与迪庆藏猪(DQ)遗传距离较近。此次采样的明光小耳猪属于华南型与高原型过渡类型，产于云南省腾冲县，且大多数明光小耳猪生活在海拔在1 000～3 000的高寒山区，以明光乡为中心产区[10]。迪庆藏猪是典型的高原猪种之一，也是世界上分布海拔最高地区的猪种之一，主要分布于我省迪庆藏族自治州、怒江州的贡山和丽江地区的宁蒗、丽江等县，部分分布在海拔3 000 m以上高山地区，其余分布在海拔2 000～3 000 m半山区与海拔2 000 m以下的河谷区，能适应高原低氧环境和恶劣的自然条件[11]。由于明光小耳猪分布的腾冲地区与迪庆藏猪分布的迪庆地区海拔与气候在一定程度具有相似性，导致明光小耳猪(MG)与迪庆藏猪(DQ)遗传距离较近。

另一结果显示迪庆藏猪(DQ)与版纳小耳猪(BN)遗传距离最远。从气候方面来看，两个地方的环境差异较大，迪庆地区属温带-寒温带气候，而西双版纳地区属热带气候地处低纬度高原，太阳辐射量大，是全国的光照高质区之一，热量丰富，终年温暖。并且在地理位置上，迪庆地区与西双版纳地区相距最远，可能两者因距离较远而发生基因交流的机会甚少，再加上较大的环境差异，导致迪庆藏猪与版纳小耳猪遗传距离最远。

通过构建系统进化树，四个地方(西双版纳、芒市、盈江县、金平县)的滇南小耳猪聚为一类，它们在进化中属于同一支，这从一定程度上显示出云南不同地方所饲养的滇南小耳猪血缘仍较纯，猪种间基因交流较少。欧阳依娜等研究10个云南地方猪种微卫星遗传多样性，结果表明位于云南省西北部相邻两个地区的高黎贡山猪与迪庆藏猪聚为一小支，再与地理距离较近的西北部的丽江猪、西南部的保山猪及西部的明光小耳猪聚为一大支[12]。本实验中明光小耳猪(MG)和迪庆藏猪(DQ)属于同一个大的分支这一结果与欧阳依娜等的研究结果相似。

6个小型猪群中，西双版纳小耳猪与迪庆藏猪遗传距离最远，符合两个种群猪种类型不同，生活环境差异大且生活的地理距离最远的特点；版纳小耳猪与金平小耳猪两个种群的地理位置较近，系统树显示遗传距离最近，属于同一分支；芒市小耳猪、版纳小耳猪、盈江小耳猪与金平小耳猪聚为一类，同属于滇南小耳猪。明光小耳猪与迪庆藏猪属于同一支，符合它们猪种类型与地理位置相近的特征。综上，六个小型猪群群体遗传距离的大小与其相对地理距离的远近和猪种类型基本吻合。