丁华胜

(南方医科大学 深圳医院 急诊科，广东 深圳 518101)

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)是临床上常见的病理生理过程，近年来研究证实中性粒细胞浸润与炎性反应在MI/RI的发生发展过程中发挥重要作用，并引起广泛关注[1,2]。高迁移率族蛋白 B1(high mobility group box，HMGB1)是Coodwin等在牛胸腺中提取发现的，可由坏死细胞被动释放或由激活的免疫细胞主动分泌至胞外，并与其受体RAGE和Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)结合，导致大量炎性介质释放并促进炎症反应[3，4]。白介素( interleukin，IL)-23是一种促炎细胞因子，广泛参与冠心病、肝病、哮喘等多种炎症性疾病，并与其下游的IL-17结合，在MI/RI中发挥重要作用[5-7]。研究显示，HMGB1与IL-23/IL-17轴在MI/RI的过程中起到了一定的作用，通过促进炎性因子的释放加重MI/RI[8]。

丹参酮 ⅡA 可扩张血管、清除氧自由基，从而有效的保护心肌细胞，并发挥抗心肌缺血的作用[9-11]。本文通过探讨丹参酮IIA在MI/RI中的作用并观察其对HMGB1、IL-23/IL-17轴表达及中性粒细胞的影响，为MI/RI的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

清洁级SD雄性大鼠，体重210～270 g，武汉大学实验动物中心提供。大鼠随机分成4组：假手术组、缺血再灌注组、丹参酮ⅡA高剂量(16 mg/kg)、低剂量组(8 mg/kg)，每组均为14只。丹参酮ⅡA 高、低剂量组分别于缺血前15 min，腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液16 mg/kg 、8 mg/kg，加生理盐水至4 mL腹腔注射[9]；假手术组及缺血再灌注组在缺血前15 min腹腔注射生理盐水，剂量为 4 mL。以上四组大鼠成功造模后立即处死，采集其心脏标本进行相关指标检测。

1.2 材料

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液由上海药业生产，批号 H31033442，2 mL：10 mg；戊巴比妥钠由山东鲁南制药厂生产；HMGB1兔多克隆抗体、IL-23兔多克隆抗体及IL-17兔多克隆抗体购自于英国abcam公司；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 心肌缺血再灌注损伤模型的构建

取SD大鼠，戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定，接入呼吸机，在胸骨第4肋间进行开胸处理，分离心包暴露心脏，将4-0丝线穿过左心耳下缘冠状动脉前降支起始部约3 mm 处，结扎线下放置乳胶管(直径1.5 mm)，拉紧结扎线后打结，阻断血流45 min后松开结扎线灌注2 h[12]。MI/RI模型成功的标准：心电图显示结扎后ST-T升高，松开后ST-T降低。对应的 ST 段显著抬高则判断冠状动脉结扎成功，ST段降低幅度超过1/2或抬高的T波下降(有时出现心律失常或病理学Q波)为MI/RI成功标志。

1.4 指标检测

1.4.1 梗死心肌面积的测定

再灌注2 h后立即结扎冠状动脉，并于颈动脉处注射伊文斯蓝 1.5 mL，随后将心脏取下用PBS缓冲液进行冲洗，将脂肪、心房、血管等无关组织丢弃，再用滤纸把左心室水分去除后放置在冰箱(零下20℃)内进行冷冻处理。之后由心尖部向上将心脏切成5 片，各段的厚度保持一致，接着进行TTC染色处理。其中未染色区对应的是危险区(area at risk，AAR)而灰白色区为梗死区(infarct size，IS)，由此计算梗死面积百分比(IS/AAR%)。

1.4.2 心肌组织IL-23及IL-17的检测

采用 Western Blot法对心肌组织中IL-23及IL-17的表达水平进行检测。再灌注2 h后，取结扎线下左心室心肌组织进行检测，基于实验要求制备12% PAGE凝胶，电泳后进行转膜，脱脂奶粉封闭，4℃一抗孵育过夜，HRP标记的二抗孵育后，进行ECL显色。以β-actin为内参进行分析，检测蛋白的表达水平。

1.4.3 HMGB1蛋白的检测

采用免疫组化检测HMGB1蛋白的表达，光镜下观察，心肌细胞胞浆存在棕黄色均质颗粒则为阳性。随机采集5个高倍视野图像，对各切片对应的图像通过 Image Pro Plus 5.0软件处理，且对其中阳性细胞染色的平均积分光密度(average integral optical density，AIOD)值进行求解，此值与HMGB1蛋白含量呈正比关系。

1.4.4 心肌髓过氧化物酶活力

另取部分心脏，由生理盐水进行洗涤，匀浆后3 500 r/min×10 min离心处理，比色法在460 nm条件下对上清液A 值进行检测，由此计算MPO活力，详细流程应严格参照MPO试剂盒说明书。

1.5 统计学方法

对实验过程中采集的数据采用SPSS 19.0软件处理。计量资料以均数±标准差描述，多组差异进行单因素方差分析，组间差异进行q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮IIA对MI/RI大鼠心肌梗死面积的影响

由TTC染色法可知，对缺血再灌注组实施缺血(45 min)/再灌注(2 h)处理后，大鼠心肌梗死面积在36.41%左右，丹参酮IIA高、低剂量组心肌梗死面积为程度不等的区域变小，以高剂量组梗死面积区域更小，差异均有统计学意义(均P<0.01)，见图1。

2.2 各组大鼠心肌坏死区组织IL-23及IL-17蛋白的表达

如图2，与假手术组相比，MI/RI组大鼠心肌组织IL-23及IL-17蛋白的表达水平明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与MI/RI组相比，丹参酮IIA高、低剂量组，都可使IL-23及IL-17蛋白水平下降，其中丹参酮IIA高剂量组下降更为明显，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

2.3 各组大鼠心肌坏死区组织HMGB1的表达

与假手术组相比，MI/RI组HMGB1表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与MI/RI组相比，丹参酮IIA高、低剂量组HMGB1表达明显下降，且高剂量组较低剂量组下降更为明显，差异均有统计学意义(均P<0.01)，详见图3A～3E。

2.4 各组大鼠心肌坏死区组织MPO的活性

与假手术组相比，MI/RI组MPO表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与MI/RI组比较，丹参酮IIA高、低剂量组明显下降，尤以高剂量组下调最明显，差异均有统计学意义(均P<0.05)，表明丹参酮IIA可抑制MPO的活性，详见图3F。

3 讨论

心肌缺血后尽快行再灌注治疗对减少心肌梗死面积、改善心功能有着重要意义，但再灌注治疗也会引发更严重的心肌损害，导致心功能的进一步恶化。MI/RI的机制复杂，包括氧化应激、炎性反应、钙超载、中性粒细胞浸润等[1]。在本研究中，我们通过丹参酮IIA预处理，建立大鼠MI/RI模型，发现在丹参酮IIA作用下，减少炎性细胞因子IL-23及IL-17的释放、抑制MPO的活性、缩小心肌梗死面积，改善了MI/RI。

中性粒细胞浸润在MI/RI发生发展中发挥关键作用。在MI/RI中，激活态中性粒细胞汇聚至心肌组织，使得心肌细胞受损与功能丧失表现得更为严重，如细胞毒性产物与炎性介质的释放、氧自由基的产生、无复流现象(黏附于微循环导致)、内皮细胞功能障碍加重等[1]。MPO为中性粒细胞所特有、并反映中性粒细胞浸润的程度[2]。此次研究结果证实丹参酮IIA预处理能够明显减弱心肌MPO活性，尤以高剂量组更为明显。因此，丹参酮IIA可通过减少中性粒细胞浸润、抑制炎性反应，保护MI/RI中受损的心肌细胞。

HMGB1主要在人体内的一些重要脏器以及组织中广泛存在，比如心、肝、脾、肺、肾、脑等，在肝、脑组织中HMGB1主要存在于细胞质外，在其他大多数组织中 HMGB1存在于细胞核[4]。表达HMGB1的基因位于染色体13q12，通过一定的转录翻译形成[13]。HMGB1调控炎症反应的方式包括如下几种：①正常情况下，一些凋亡细胞会在被吞噬前释放HMGB1，进行消解而起到清除杂物效果；②严重炎症情况下，大量巨噬细胞释放出过量HMGB1，加重炎性反应，导致病情加重[4]。IL-23由活化的树突状细胞及巨噬细胞分泌，其对炎症反应可起到促进作用[14]，其受体在T 细胞、巨噬细胞表面大量分布。IL-23主要作用于Thl7细胞，促进Thl7细胞分泌IL-17，因此在Thl7细胞的发育与增殖中发挥重要作用。相关研究结果表明，IL-23/IL-17轴在MI/RI调节中的作用尤为重要，其主要通过HMGB1介导[8,15]。本研究发现丹参酮IIA可降低HMGB1的含量，抑制炎性因子IL-23及IL-17的蛋白表达。

总之，丹参酮IIA能够降低缺血梗死心肌组织中HMGB1及IL-23/IL-17轴的表达，减轻中性粒细胞浸润，缩小心肌梗死面积，改善MI/RI。