张会寅，郭钟宁，邓 宇，黄志刚，邬泽聿

（1.广东工业大学机电工程学院，广州 510006；2.广东工业大学省部共建精密电子制造技术与装备国家重点实验室，广州510006；3.广州市非传统制造技术及装备重点实验室，广州 510006）

0 引言

细胞计数在医学、农业、环境评估、食品生产等领域有着广泛的应用[1-4]。细胞计数的其中一个应用为牛奶体细胞计数。一般情况下，即使是健康的奶牛，生产的牛奶也含有少量乳腺凋亡的细胞。如果牛奶中的体细胞浓度增大，那么奶牛患乳房炎的概率将大大增加。而且牛奶中的体细胞增多，对牛奶的口感和质量影响很大[5]。目前细胞计数的方法有显微计数法、图像计数法[6]、阻抗计数法[7]、流式计数法[8]等。其中阻抗计数法和流式计数均为绝对计数，即细胞逐个通过检测位，相关传感器检测到细胞通过而计数。因此如何使细胞单个通过检测位置和精确感应单个细胞信号是细胞计数精度的关键。

微流控芯片即芯片上的实验室，力图将传统检测微型化、自动化、便携化。微流控技术中，有一种被动粒子控制技术叫惯性聚焦，带有微米级粒子通过设计的流道即可实现粒子的排序。然而惯性聚焦对粒子大小的选择性较大，不同粒径大小的粒子在同一流速下，通常聚焦的位置是不一样的，因此很多人利用这一特性进行粒子分选。也有人提出使用惯性聚焦作为细胞计数的细胞聚焦方式，研究单一粒径的微粒子模拟细胞聚焦的可行性[9]。然而一般情况下细胞的大小是有差别的，单一粒径微球的聚焦模拟实验并不能完全代表实际情况。

本文根据细胞大小及惯性聚焦理论设计惯性聚焦微流道，然后以极限尺寸以及平均细胞大小的聚苯乙烯微颗粒探究聚焦规律。利用得出的单一粒子的聚焦规律，选择合适的流速，用混合粒子验证聚焦效果。

1 惯性聚焦理论及流道设计

惯性聚焦分直线惯性聚焦和弯道惯性聚焦。由于直线惯性聚焦的平衡位置一般为多个[10]，而弯道惯性聚焦存在二次流，平衡位置只有一个[11]。因此为实现单一细胞通过检测位置，弯道惯性聚焦较合适。弯道惯性聚焦中，有螺旋型[12]、正弦型[11]、方波型[13]等聚焦流道。由于螺旋型聚焦流道设计比较复杂，方波型聚焦流道比较适合粒子分离，因此本文尝试采用正弦型流道作为多粒子聚焦流道。

1.1 惯性聚焦理论

正弦型流道聚焦流道COMSOL流场仿真截面如图1（a）所示，可以看到垂直于截面的速度场左右流速不对称，左侧的速度梯度大于右侧。除了垂直截面的速度，还存在截面方向的速度，如图中箭头所示。粒子在这样非对称惯性聚焦流道中，受到由速度梯度和壁面的作用形成的惯性升力FL，以及由二次流作用产生的斯托克斯曳力，也称迪恩曳力FD[11]，如图1（b）所示。其中惯性升力FL的表达式如下：

式中：ρ为流体密度；Um为流道中最高流速；CL为升力系数，和粒子在流道截面中的位置有关；a为粒子直径；Dh为流道水力直径。

图1 COMSOL流场仿真流速分布和粒子在二次流中受力示意图

迪恩曳力FD的表达式如下：

式中： μ为流体的动力黏度；UD为二次流的平均流速；a为粒子的直径。

影响粒子聚焦的力主要为以上两个力，而这两个力的大小和粒子所处的位置相关，当惯性升力和迪恩曳力相等，则此时粒子所处的位置就是粒子的平衡位置。

1.2 流道设计

实验表明，粒子直径a和流道的水力直径Dh需要满足以下条件才能实现粒子聚焦[11]。

式中：w为流道宽度；h为流道深度。

对于直径为7μm、10μm、12μm的微球，设计了如图2所示流道，深度为50μm，大弯道平均半径和宽度为665μm和400μm，小弯道平均半径和宽度为200μm和200μm。高速摄影位置为如图2所示聚焦末端。

图2 流道示意图

2 聚焦实验

2.1 单一粒径粒子实验及结果分析

用聚苯乙烯微球模拟细胞进行实验。聚苯乙烯微球为天津市倍思乐色谱技术开发中心的Unibead单分散相聚苯乙烯微球。正常牛奶体细胞浓度为20万个/mL～30万个/mL[5]。分别将7μm、10μm、12μm配置为25万个/mL，然后分别以50μL/min的速度梯度，从100μL/min到1 000μL/min注射微颗粒。高速摄影仪拍摄视频，采集频率4 000 Fps，曝光时间15μs，然后用ImageJ叠加视频帧，观察相应速度粒子的位置分布情况。

图3所示为7μm微球在高速摄影视频帧叠加图，在流速小于550μL/min时，微颗粒没有形成可靠聚焦；微颗粒完全离散或者少量游离于聚焦轨道。当流速大于或等于550 μL/min时，粒子可靠聚焦。图4所示为10μm微球在高速摄影视频帧叠加图，在流速小于500μL/min时，微颗粒没有形成可靠聚焦；微颗粒完全离散或者少量游离于聚焦轨道。当流速大于或等于500μL/min时，粒子可靠聚焦。图5所示为12μm微球在高速摄影视频帧叠加图，在流速小于350μL/min时，微颗粒没有形成可靠聚焦；微颗粒完全离散或者少量游离于聚焦轨道。当流速大于或等于350μL/min时，粒子可靠聚焦。

图3 7μm聚苯乙烯微球高速摄影视频帧叠加图

图4 10μm聚苯乙烯微球高速摄影视频帧叠加图

图5 12μm聚苯乙烯微球高速摄影视频帧叠加图

在正弦型聚焦流道的单一直径粒子聚焦中，聚焦的本质为粒子在流体中，惯性升力和迪恩曳力的平衡，而平衡位置只有一个。单一粒子的聚焦，粒子轨道相同，而且粒子不可能同时存在同一位置，因此粒子与粒子之间存在相互作用，使得粒子之间总是存在一定的间距。因此，为进一步说明聚焦的聚焦效果，如图6所示，本文定义了聚焦宽度和聚焦轨道位置为评价粒子聚焦效果，聚焦宽度为视频帧叠加图的叠加轨迹宽度；聚焦位置为聚焦中心到流道内侧的距离。使用ImageJ的Plot Profile功能对视频帧叠加图进行灰度分析。测量粒子轨迹的宽度以及聚焦中心位置，测量出来的宽度以及中心位置趋势如图7和图8所示。

图6 聚焦宽度d和聚焦位置h示意图

图7 流速与微球粒径对聚焦宽度的影响

图8 流速与微球粒径对聚焦中心位置的影响

聚焦宽度趋势如图7所示，在可以实现微颗粒可靠聚焦的流速下，随着流速的增加，7μm、10μm、12μm的微粒子聚焦的宽度均有成线性变宽的趋势。其中7μm微球聚焦宽度变化率最大，流速从550μL/min变化到1 000μL/min，微球聚焦宽度从23.99μm变化到55.1μm；10μm微球聚焦宽度变化率次之，流速从500μL/min变化到1 000μL/min，宽度从27.3μm变化到39.9μm；12μm宽度变化率最小，流速从350μL/min变化到1 000μL/min，微球聚焦宽度从19.6μm变化到34.5μm，聚焦宽度基本保持恒定。

聚焦位置趋势如图8所示，在可以实现微颗粒可靠聚焦的流速下，无论粒径大小，粒子聚焦轨道的中心位置明显有随流速的增大而线性增大的趋势。这是因为当流速增大，由于二次流的流速增大，由式（2）可知，迪恩曳力会增大。由式（1）可知，惯性升力的大小除了和流速有关以外，还和升力系数相关，升力系数在一定范围内，偏离侧壁距离越大，系数越大[14]，因此平衡位置会随着流速增大而偏离内侧壁。

2.2 混合粒子实验

相对于单一粒子聚焦，多粒子聚焦由于粒径的差异导致聚焦轨道出现差异，另外粒子之间的距离要尽量大，而粒子之间的距离产生原因为同一轨道上粒子之前的相互作用。因此对于多粒子聚焦要使得粒子的聚焦轨道差异尽量小，聚焦宽度尽量小，才能很好地控制粒子之间的距离。结合图7和图8，将3种粒子的轨道进行叠加，得到如图9所示的粒子轨道叠加宽度图。在流速为550μL/min时，此时轨道最能满足轨道相近，聚焦宽度小的条件。在这个流速下，3个轨道叠加的宽度为32.213μm，聚焦位置为51.907μm。

混合3种粒径的粒子，以550μL/min流速进行实验。观测粒子的聚焦情况，与单一粒子聚焦叠加轨道进行对比。实验效果图10所示。图10（a）为高速摄影仪拍摄的视频帧，可以看到，粒子可以实现粒子间距拉开。图10（b）为高速摄影仪拍摄的视频帧叠加图，可以看到，粒子可以实现稳定聚焦，稳定聚焦的宽度为32.8μm，聚焦位置为51.45μm，和单一粒子聚焦轨道的叠加相近。

图9 粒子轨道叠加宽度图

图10 混合粒子聚焦实验

3 结束语

采用实验方法，研究单一粒子在惯性聚焦流道中，不同流速的情况下，粒子的聚焦宽度及聚焦轨道位置。另外混合多种粒子实验，验证了多粒子在同一惯性聚焦流道聚焦的可行性。

（1）同一粒子在同一惯性聚焦流道中聚焦，流速到达一定值才能实现可靠聚焦；粒子直径越小，需要的流速越高；流速越高，粒子的聚焦宽度越大；聚焦的中心位置，越偏离流道内侧壁。

（2）混合粒子在设计的流道能实现稳定间距聚焦，其轨道可以通过粒子单一粒子的轨道的叠加预测聚焦轨道和宽度。和传统的细胞计数流道相比，本流道可以实现鞘液聚焦的效果，为细胞绝对计数提供基础，省去鞘液的注射，简化细胞计数液路。