宋尚桥 马围围 曾素先 严瑾 孙翠翠 李鑫 黎宗强

摘要：为探讨直径为2 mm以下和2～6 mm猪卵泡卵母细胞的体外培养分裂率与囊胚率差异，采用相同体外成熟培养条件，来培养从不同直径的2种卵泡中所抽出的卵母细胞，在卵母细胞成熟培养后44～48 h，对卵母细胞进行化学激活和体外培养，观察胚胎体外发育能力;在培养48 h时进行分裂数据统计，培养168 h时统计囊胚个数。结果发现，2 mm 以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率差异显著，分别为62.46%、81.76%（P<0.05）;2 mm以下猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率差异不显著，分别为11.71%、15.30%。说明正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞在体外成熟后，孤雌激活胚分裂率依次降低，孤雌胚胎的分裂能力随卵泡直径的增大而增强;正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞体外成熟后，孤雌激活胚囊胚率随卵泡直径的增大有一定增高，但变化不显著。

关键词：猪;小腔卵泡;孤雌激活;分裂率;囊胚率

中图分类号：S852.1

文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2020）16-0205-03

对于卵母细胞成熟体系、胚胎发育体系、胚胎干细胞体系的建立及体细胞核移植效率的提高仍需要依赖于各技术环节的进一步完善[1]，而孤雌激活胚胎的准备是其中不可或缺的一个环节，也是非常重要的影响因素之一[2]。因此，对于小腔卵泡孤雌激活胚胎发育率的研究显得十分必要。在猪卵巢卵母细胞体外成熟、孤雌激活方面的研究，目前已取得关键性突破[3]。只有卵泡直径达2 mm时，卵泡内的卵母细胞才具有体外成熟的能力[4]。卵巢上分布着许许多多的细胞，不仅包括少量的大腔卵泡卵母细胞，还包括数以万计的腔前卵泡卵母细胞和小腔卵泡细胞，这些细胞是供给进行体外培养所需成熟卵母细胞的潜在重要支柱[5]。早在1996年，Tsafriri等在体外培养猪1～2 mm卵泡的卵母细胞，获得15%～25%的成熟率[6]。本研究对猪小腔卵泡卵母细胞的体外成熟孤雌激活胚胎发育率进行探索，以期为猪的多种试验研究提供宝贵材料，如体外受精试验、核移植试验等，为对卵母细胞在体外培养过程中发育机制的探索有重要价值和研究意义[7-8]。因此，直径<2 mm的卵泡的卵母细胞体外成熟的孤雌激活发育能力及其机制将逐渐被揭示。通过对猪小腔卵母细胞孤雌激活后体外发育能力的研究，为解决猪卵巢资源紧张提供新的资源。

1 材料

1.1 试验样品的采集

从广西大学附近的屠宰场获得新鲜猪卵巢，将其放置于30～35 ℃装有生理盐水的保温瓶中，在 1 h 内运回实验室进行相关的试验操作。

1.2 主要试剂

本研究所用化学试剂除特别指明外，均购自Sigma公司，如洗卵液（CCM）、胚胎培养液（NCSU）、体外成熟培养液（M）、离子霉素、2，6-二甲苯酚（6DMP）;促卵泡激素（FSH）和促黄体生成素（LH），购自中国科学院动物研究所;培养用仪器为TCM-199，购自Gibco公司;一次性塑料皿，购自NUNC公司。

2 方法

2.1 卵母细胞的收集

用带针头的注射器分别抽取卵巢表面上直径<2 mm 和直径为2～6 mm的卵泡的卵母细胞，并将2～6 mm卵泡的卵母细胞设为第1组，直径<2 mm 卵泡的卵母细胞设为第2组。在实体显微镜下用玻璃吸管吸取带2层卵丘细胞以上、胞质均匀的卵母细胞，之后以具有完整卵丘细胞层的标准筛选卵母细胞，将筛选得到的卵母细胞用CCM洗净后，以30～60枚为1组移入含1.5 mL成熟培养液的玻璃平皿（30 mm×10 mm）中，设定体外成熟培养条件为：38.5 ℃、5% CO2及饱和湿度。将不同组的卵母细胞作好标记分开成熟培养。

2.2 猪卵母细胞的孤雌激活

在猪卵母细胞体外成熟培养44～48 h后，向其中加入含0.1%透明质酸酶的洗卵液除去卵丘细胞，并用枪头轻轻吹打。然后在40倍体视显微镜下检查卵母细胞是否排出第一极体，以排出第一极体作为卵母细胞核成熟的标志。挑取核成熟卵母细胞，采用5 μmol/L离子霉素处理5 min后，用 2.5 mmol/L 二甲氨基嘌呤处理4 h，最后移至 100 μL/滴的胚胎培养基中置于培养箱中培养 168 h，并设定培养条件为：39 ℃、5% CO2饱和湿度。将不同组胚胎作好标记分开培养。

2.3 猪孤雌激活胚胎发育力数据统计

在胚胎培养48 h时，统计孤雌激活胚胎发育分裂率;在培养168 h时，统计孤雌激活胚胎发育囊胚率。所得试验结果均用SPSS 11.0软件进行统计分析，对计量资料进行t-检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 猪小腔卵泡与正常直径卵泡卵母细胞孤雌激活胚胎分裂率

由表1可知，2 mm以下卵泡卵母细胞（小腔卵泡卵母细胞）孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞（正常卵泡卵母细胞）孤雌激活后胚胎的体外培养平均分裂率分别为62.46%、81.76%，二者差异显著（P<0.05）。表明从不同直径的卵泡中抽出的卵母细胞孤雌激活后，孤雌激活胚分裂率不同，孤雌胚胎的分裂能力随卵泡直径的增大而增强。

3.2 猪小腔卵泡与正常直径卵泡卵母细胞孤雌激活胚胎囊胚率

由表1可知，2 mm以下卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率与2～6 mm猪卵泡卵母细胞孤雌激活后胚胎的体外培养平均囊胚率分别为11.71%、15.30%，二者差异不显著（P>0.05）。表明從正常卵泡、小腔卵泡中抽出的卵母细胞孤雌激活后，孤雌激活胚囊胚率与卵泡直径大小有一定的关系，囊胚率随卵泡直径的增大而增高，但正常卵泡与小腔卵泡所抽出的卵母细胞囊胚率相比，差异不显著。

4 讨论

进入20世纪90年代后，有更多学者投身于小腔卵泡的研究，猪小腔卵泡的体外成熟研究已经相当普遍，但体外成熟小腔卵泡的孤雌激活研究较少[9-10]。Tsafriri等对猪的1～2 mm卵泡卵母细胞进行体外培养，发现其成熟率达到15%～25%[11]。家畜小腔卵泡卵母细胞仍然需要经历很多复杂多变的生理生化过程才能具有恢复和完成成熟分裂的能力。相关研究表明，猪卵母细胞的成熟率和卵泡直径呈正比[12]。在体内正常生理条件下，卵母细胞发育程度与卵泡直径呈正比。猪小腔卵泡卵母细胞正处于生长后期，进行活跃的RNA合成，其体外成熟能力低于2～6 mm卵泡的卵母细胞[13-14]。研究显示，2 mm以下卵泡和2～6 mm卵泡的卵母细胞孤雌激活胚胎分裂率分别为52.63%、80.39%，二者有显著差异[7]。

囊胚率是分析胚胎发育情况的一个指标[15]。直至目前，大多数的科学研究做猪卵母细胞孤雌激活试验时，都热衷于以胞质均匀、包裹多层卵丘细胞的卵母细胞为研究对象[16]。已有的相关研究表明，扩展的卵丘细胞可以通过调节物质的通透性，诱捕卵母细胞排出的有害物质，从而达到有效抑制卵母细胞死亡和退化的效果[17]。但从小腔卵泡中抽出的卵母细胞孤雌激活后的囊胚率却很高，和 2～6 mm 卵泡的卵母细胞孤雌激活胚胎的囊胚率差异不显著，表明卵泡大小对卵母细胞体外成熟、体外发育有重要影响。

5 结论

研究发现，正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞体外成熟后，孤雌激活胚分裂率依次降低，说明孤雌胚胎的分裂能力随卵泡直径的增大而增强;正常卵泡、小腔卵泡的卵母细胞体外成熟后，孤雌激活胚囊胚率随卵泡直径的增大有一定的增高，但变化不显著;从猪小腔卵泡中抽出的卵母细胞有一定的发育能力，在收集卵母细胞的时候，也应该适当挑取一部分直径小于2 mm的小腔卵泡，增加卵母细胞的数量，为试验提供更多的材料。

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