郭永梅 胥彦琪

化学性肝损伤是我国常见疾病之一，其发病率在呈现逐年上升的趋势，且无有效的治疗手段。根据现代研究表明，在人及哺乳动物的肝脏内，乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH2）构成了乙醇脱氢酶体系，参与体内乙醇代谢[1]。乙醇脱氢酶氧化体系是肝脏代谢酒精的一条重要途径。葛根和枳椇子都是中国传统医学中极具代表性的护肝药物，二者对化学性肝损伤均具有显著的保护作用[2-3]，其主要有效成分为黄酮类的化合物，但其溶解度低、稳定性差、口服具有首过效应，生物利用度低，如何提高黄酮类天然药物的生物利用度，一直是药剂学领域的一个难题[4]。

脂质体作为一种新型药物载体，具有提高制剂稳定性及药物溶出的优点[5]。将PHTF 制备成口服脂质体制剂，以期其具备脂质体优点，并能克服传统剂型生物利用度低的缺点，最终增加PHTF 在机体中吸收和口服生物利用度[6]。目前，尚无关于制备葛根-枳椇子配伍制备脂质体的报道，故本实验将进行相关研究，并对PHTF 口服脂质体的质量进行评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器

T6 紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；FA2004 电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪；JSM-7500F 扫描电镜（日本电子株式会社）；MS-2000激光粒度分析仪（英国malvern 公司）；KQ3200DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-16G 高速离心机（上海安亭科学仪器厂）

1.2 药品及试剂

葛根总黄酮提取物（陕西森弗天然制品有限公司，批号：GGE20180722 总黄酮≥85.0%）；枳椇子总黄酮提取物（陕西森弗天然制品有限公司，批号：JJZ20180814 总黄酮≥75.0%）；芦丁（中国食品药品检定研究院，批号：100080-201810）；乙醇脱氢酶（sigma 公司，批号：A3263）、乙醛脱氢酶（上海源叶生物科技有限公司，批号：S10195）；β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，Roche 公司）；磷酸二氢钾（上海展云化工有限公司）、氢氧化钠（上海展云化工有限公司）；大豆卵磷脂（德国Lipoid Gmbh 公司）；胆固醇（德国Merck 公司）。

2 方法与结果

2.1 PHTF 的配比对酶活性的影响

2.1.1 ADH/ALDH2 酶活性的测定方法

取具塞试管，加入pH7.4 磷酸盐缓冲液2.0 ml、NAD+溶液0.188 mmol/ml，并加入一定浓度的样品溶液及酶溶液（ADH 或ALDH2）0.2 ml，加盖，25 ℃温育5 min，加入相应的底物溶液，立即用紫外-可见分光光度计于340 nm 测定吸光度A 值，以后每隔10 s 读数一次，连续测定5 min，记录结果，计算酶活力激活率。

2.1.2 PHTF 配比对ADH 酶和ALDH2 酶活性的影响

将PTF 与HTF 分别按照5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1:5的比例进行配比，即得PHTF。分别精密称取一定量不同比例的PHTF，制备成5.0 mg/ml 的供试品溶液，固定加样量为0.5 ml。并对其复合物的酶激活能力进行研究。不同比例的PHTF 对ADH酶和ALDH2 酶的影响如图1 所示。从图中可以看出，当复合物中PTF 与HTF 的比例为1∶2 时，复合物对ADH 酶的激活率为59.3%，对ALDH2 的激活率为54.5%，均维持较高水平，因此确定PTF 与HTF 配比为1∶2。

图1 葛根总黄酮-枳椇子总黄酮复合物对AND 酶和ALDH2酶活性的影响

2.2 PHTF 含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品10.32 mg，置于25 mL 容量瓶中，加60%乙醇适量，超声溶解，再加60%乙醇稀释至刻度摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备

精密称取一定量的PHTF（约相当于总黄酮10 mg），置于25 ml 容量瓶中，用适量60%乙醇超声溶解，摇匀过滤，即得供试品溶液。

2.2.3 UV 检测波长的确定

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定总黄酮含量。标准品和样品溶液按显色后，以随行试剂为对照空白，于200～600 nm 波长范围扫描，见图2。标准品和样品在508 nm 波长处均具有最大吸收，故确定检测波长为508 nm。

2.2.4 标准曲线绘制

图2 芦丁标准曲线

精 密 吸 取对 照 品 溶 液1 mL，1.5mL，2mL，2.5mL，3mL，3.5 mL，置于10 ml 容量瓶中，按“2.2.3”项下方法显色，以随行试剂为对照空白，照紫外-可见分光光度法在508 nm 的波长处测定吸收度值。以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=5.1 460X+ 0.0 962（r = 0.9 996），结果表明，在0.0413 mg/mL～0.1445 mg/mL 范围内与吸光度值呈良好的线性关系。结果如图2。

2.3 工艺优化

2.3.1 脂质体制备采用逆向蒸发法

分别取大豆卵磷脂、胆固醇适量，溶于30 mL 无水乙醇中，作为有机相；取总黄酮适量，溶于10 mL PBS（PH7.0）中，作为水相。将水相与有机相混合，水浴超声处理，直至形成均匀乳剂，移至梨形瓶中，水浴减压除去无水乙醇，达到胶态后滴加适量PBS 溶液（PH7.0），继续减压蒸发使其充分水化，0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.3.2 脂质体包封率测定

采用离心法。精密量取脂质体1 mL，加50 mL 甲醇破乳后再稀释10 倍，于508 nm 处测吸光度，计算PHTF 含量（W 总）。精密量取脂质体上清液1 mL，10 000 r/min 离心30 min，取上清液10 μL，甲醇定容至5 mL，测定吸光度，计算游离PHTF 含量（W 游），计算包封率。

2.2.3 药物与卵磷脂比对包封率的影响

固定处方及工艺中的其他因素不变，改变卵磷脂：药物（w/w）的比例，分别按6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1 制成PHTF 脂质体，测定其包封率分别为54.2%、58.3%、62.9%、59.6%、58.7%。结果表明药物与卵磷脂的比例（w/w）为1∶10 时所制得的PHTF 脂质体包封率最高。

2.3.4 卵磷脂与胆固醇比例对包封率的影响

固定处方及工艺中的其他因素不变，改变卵磷脂：胆固醇（w/w）的比例，分别按2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 制成PHTF 脂质体，测定其包封率分别为53.4%、56.7%、61.2%、59.3%、55.2%。结果表明卵磷脂与胆固醇的比例（w/w）为4∶1 时所制得的PHTF 脂质体包封率最高。

2.3.5 有机相与水相比例对包封率的影响

固定处方及工艺中的其他因素不变，改变有机相：水相（V/V）的比例，分别按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 制成PHTF 脂质体，测定其包封率分别为52.5%、58.6%、62.4%、59.4%、55.2%。结果表明卵磷脂与胆固醇的比例（w/w）为4∶1 时所制得的PHTF 脂质体包封率最高。

2.3.5 水浴温度对包封率的影响

固定处方及工艺中的其他因素不变，考察水浴温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，制备PHTF 脂质体，测定其包封率分别为56.3%、58.3%、61.8%、60.3%、59.9%。结果表明，水浴温度为40℃时，PHTF 脂质体包封率最高。

2.3.6 正交实验优化

以包封率为主要指标，结合单因素试验结果，对水浴温度（A）；有机相与水相比例（V/V）（B）；卵磷脂与胆固醇比例（w/w）（C）；药物与卵磷脂比（w/w）（D）；四个因素进行4 因素3 水平实验，选用L9（34）正交表安排实验，制备PHTF 脂质体，测定包封率。结果见表1。

从表中按极差R 值大小排序，C＞D＞B＞A，即卵磷脂与胆固醇的质量比是影响包封率的主要因素。按照A2B3C2D1 组合制备的PHTF 脂质体包封率为68.1%，优于其他组合的包封率。因此确定水浴温度为40℃，有机相与水相的比例为4∶1，卵磷脂与胆固醇的比例为4∶1，药物与卵磷脂比例为1:8 为最优处方。

表1 正交实验结果

2.4 验证试验

按最优处方制备3 批PHTF 脂质体，测定其包封率分别为68.2%、68.4%、67.7%。平均包封率为68.1%。由测定结果可知该处方制备条件稳定可行。

2.5 PHTF 脂质体的质量评价

2.5.1 PHTF 脂质体的外观形态

图3 脂质体电子显微镜图

按最优处方制备脂质体，外观为淡黄色乳状液体。PBS（PH7.0）稀释至适当浓度，取适量滴于铜载体，1 min 后滤纸吸去多余样液，2%磷钨酸溶液进行负染，30 s 后滤纸吸去余液，晾干，于电镜在观察PHTF 脂质体形态并拍照，结果见图3。由图可见，脂质体外观圆整，粒径均一，为球状或类球状的小囊泡。

2.5.2 粒径分布

取逆向蒸发法制得的PHTF 脂质体，纯水稀释后测定粒径，平行3 次，结果见图5，测得平均粒径为（160.7±12.0）nm，粒度分布较为均匀。

2.5.3 Zeta 电位的测定

取PHTF 脂质体适量，纯水稀释后测定，结果见图5，3 批脂质体Zeta 电位为（-41.4±2.3）mV，表明PHTF 脂质体具有较好的稳定性。

图4 脂质体粒径分布

图5 脂质体Zeta 电位

2.5.4 PHTF 脂质体的载药量

表2 总黄酮含量测定结果

取最优工艺制备的3 批PHTF 脂质体，通过离心法测定其载药量，计算公式为，结果见表2。实验证明逆向蒸发法制得的PHTF 脂质体具有较高的载药量，符合要求。

2.5.5 稳定性考察

取3 批PHTF 脂质体置于玻璃瓶中，将其在室温条件（25℃）下放置60d，分别于0、7、15、30、60d 观察其形态变化、平均粒径、包封率、Zeta 电位及pH 值，结果见表2。在60d 的稳定性考察中，PHTF 脂质体外观无变化，无浑浊，平均粒径、包封率、Zeta 电位及pH 值基本不变，说明PHTF 脂质体在25℃条件下60d 内稳定。

表3 稳定性考察结果

3 讨论

本实验采用逆向蒸发法成功制备PHTF 脂质体，并分别用单因素实验考察了各个因素对制备脂质体的影响。在单因素实验的基础上用正交试验进行了处方优化。考察了水浴温度、有机相与水相比例（V/V）、卵磷脂与胆固醇比例（w/w）、药物与卵磷脂比（w/w），结果显示逆向蒸发法制备的脂质体方法简单、效果良好。通过Valle-Hoch 法检测不同比例的PHTF 对ADH 和ALDH2 的激活率的影响，确定PTF 和HTF 最优配比为1∶2。通过正交试验确立了逆向蒸发法制备PHTF 脂质体的最佳处方为药脂比1∶8，磷脂胆固醇比4∶1，有机相与水相比例4∶1。并确定了制备工艺中旋转蒸发时的最佳水浴温度为40℃。制得的PHTF 脂质体为浅黄色的液体。

通过三批次验证试验，测得PHTF 脂质体平均包封率为68.1%，平均总黄酮含量为18.40%，证明制备方法可行，具有较好的含药量。并通过初步稳定性考察显示，PHTF 脂质体在常温条件（25℃）下具有良好的稳定性，60d 无明显变化，从而确保了PHTF 脂质体用药安全性和稳定性。

本次实验仅考察了PHTF 体外分析方法的建立，且方法单一，不能有效评价PHTF 脂质体的药效及生物利用度。后续课题组将建立系统的、多指标的评价分析方法，并进行体内的药代动力学实验。