周兴卓 沈丽霞 王莉娜

樟树在中国资源较为丰富，是中国亚热带阔叶林的主要树种之一[1]。樟树根系樟科植物樟的干燥根，具有活血化瘀、祛风除湿、通利关节等多种作用，临床上主要用于关节酸痛、跌打损伤等疾病的治疗[2]。研究表明，樟树根中具有黄酮类、挥发油类等成分，是樟树根中主要活性成分[3]。目前，樟树根中总黄酮的提取工艺主要通过正交试验优化[4]，而未见通过响应面法优化的研究报道。相比于正交试验，响应面法具有试验次数少、周期短等优点，已广泛用于中药有效成分提取工艺优化。因此，本试验利用响应面法对樟树根总黄酮的提取工艺进行优化，为进一步开发利用樟树根提供依据。

1 材料与方法

1.1 药材

樟树根收集于康恩贝中药有限公司，经江西医学高等专科学校药学系黄平药师鉴定为樟树根。

1.2 试剂

芦丁（纯度99.1%，批号100080- 201810），购至成都埃法生物有限公司，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。

1.3 仪器

UV- 2100 紫外分光光度计（日本岛津有限公司）；KQ- 600KDE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SB- 2000 旋转蒸发器（上海亚龙仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮的提取

精确称取粉碎后的樟树根样品1.0g，置于50mL 锥形瓶中，加入一定体积分数的乙醇，在一定超声波功率、超声温度下，提取一段时间，对所得提取液进行减压抽滤，旋转蒸发、浓缩，得樟树根总黄酮样品。

2.2 标准曲线的制作

准确称取经芦丁10.0 mg，置于50 mL 量瓶中，加入70%乙醇溶液溶解定容，得对照品溶液。准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于25 m L 量瓶中，各加1mL5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min 后分别加入1mL10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6min 后分别加入10mL 4% 氢氧化钠溶液，摇匀，最后用70%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min。在波长510nm 处测其吸光值。以芦丁浓度X (mg/mL) 对吸光度Y 进行线性回归，得回归方程为:Y=6.373X+0.0046（r=0.9993）。根据回归方程计算总黄酮得率。

2.3 响应面优化

2.3.1 单因素实验

通过单因素法，对不同乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%），不同提取时间（15、30、45、60、90 min），不同液料比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1）进行考察，结果显示在乙醇浓度为70%，提取时间为30min，液料比为25:1 时，提取效率最高。

2.3.2 响应面优化实验结果与分析

（1）响应面优化实验结果

根据单因素试验结果，采用星点设计法以不同乙醇浓度（A）、提取时间（B）和液料比（c）3 个因素为自变量，每个因素取3 个水平，见表1。

表1 因素水平表

（2）实验数据分析

使用统计软件得到总黄酮得率对编码自变量A、B 和C 的回归方程：Y=12.77+0.22A+0.32B+0.04C- 0.31AB- 0.18AC-0.27BC- 0.41A2- 0.45B2- 0.73C2，该模型回归显著（P＜0.00 01），模型的复相关系数r=0.9931，说明该回归方程回归效果较好，试验误差小。模型校正决定系数R2adj=0.9947，说明该模型可信度高，失拟项的P＞0. 05，表明该模型失拟不显著，综上，星点设计- 效应面法优化樟树根的总黄酮提取工艺是可行的。

（3）响应面分析

通过多元回归方程作响应面图，可以较直观地反映各因素间的交互作用。响应面图见图1、图2 和图3。

（4）最佳提取条件的确定

通过软件Design- Expert 分析得出樟树根总黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓71.65%，提取时间34.66min，和液料比24.75。为便于操作，将测定条件修正为：乙醇浓72%，提取时间35min，和液料比25。此条件下得樟树根总黄酮得率为12.81%，与理论预测值12.84% 非常接近。说明本实验所建立的樟树根总黄酮提取工艺参数真实可靠，具有实用价值。

图1 总黄酮提取率受乙醇浓度和提取时间的交互影响

图2 总黄酮提取率受乙醇浓度和液料比的交互影响

图3 总黄酮提取率受提取时间和液料比的交互影响

3 小结

本实验在单因素试验的基础上，采用星点设计- 效应面试验设计法，首次对樟树根总黄酮的超声提取工艺进行了优化，并建立了回归模型。最终得樟树根总黄酮最佳提取工艺条件是：乙醇浓72%，提取时间35 min，和液料比25。经过验证，试验精确度较高，操作简单，经济可行，可用于樟树根总黄酮的提取。