苏红彦,李美玲,坚乃丹,张晓娜,杨虎林,栗孟飞,

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070；2.甘肃百草中药材种植有限公司，甘肃 兰州 730102；3.榆中县农业农村局，甘肃 兰州 730100)

贯叶连翘(HypericumperforatumL.)为藤黄科金丝桃属多年生草本植物，又名圣约翰草，主要分布于我国甘肃、四川和江苏等低海拔区域[1-2]，是我国传统的药用植物，具有抗菌消炎、收敛止血、消肿止痛等功效[3-4].其地上部分富含多种具有生物活性的化学成分，主要有苯并二蒽酮类化合物(如金丝桃素、伪金丝桃素和异金丝桃素等)、黄酮类化合物(如儿茶素、芦丁和金丝桃苷等)、酚类化合物(如绿原酸、咖啡酸和肉桂酰奎尼酸等)、VOCs (主要为烷类、烯类和醇类，如γ-雪松烯、α-姜黄烯和β-反-金合欢烯等)、以及氨基酸类化合物[5-7].现代药理学研究发现，贯叶连翘提取物在抗菌、抗病毒、抗氧化等方面具有显著的生物学活性，尤其对轻度至中度抑郁症治疗效果显著[8-10].因其独特的药理作用，目前已成为全球研究开发的热点草药之一[5].

为了提高贯叶连翘的产量和品质，很多学者就种质资源[11]、生长环境(如光照、温度、水分、土壤元素)[12-15]、收获期[16]等因素下活性物质(如金丝桃素、黄酮类、酚类、挥发性化合物)积累等方面做了大量研究.而对海拔影响贯叶连翘VOCs积累方面的研究鲜见报道.因此，本研究以3个不同海拔(1 000、2 300和2 800 m)同一遗传背景、两年生的贯叶连翘为试验材料，采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography- mass spectrometer,GC-MS)对地上部分乙酸乙酯和正丁醇萃取液进行分离鉴定，旨在探明海拔对地上部分非极性和极性VOCs及其积累的影响，结果将为贯叶连翘高海拔种植栽培与推广、VOCs开发和利用提供一定的理论依据和技术参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

3个海拔两年生贯叶连翘地上部分于2018年7、8、9月份花蕾期时分别采自康县(海拔1 000 m，N 33°16′20″,E 105°31′50″)、渭源(海拔2 300 m，N 34°58′10″,E 104°05′22″)、甘南藏族自治州(海拔2 800 m，N 35°5′52″,E 102°53′27″)，阴干后备用.

1.2 萃取液的制备

取阴干的材料研碎后过0.18 mm筛，准确称取1.0 g粉末置于25 mL无水乙醇，28 ℃、120 r/min振荡提取24 h，20 ℃、2 000 r/min离心20 min后收集上清液，连续提取3次.上清液在70 ℃、500 Mb、150 r/min减压浓缩至小体积，用dH2O溶解并定容至100 mL，用乙酸乙酯(体积比=1∶1)连续萃取3次；萃取液在65 ℃、400 Mb、140 r/min再次减压浓缩至小体积，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至10 mL.萃余相用正丁醇(体积比=1∶1)连续萃取3次，然后在70℃、100 Mb、120 r/min减压浓缩至小体积，用色谱纯无水乙醇溶解并定容至10 mL.乙酸乙酯和正丁醇萃取液分别置于4 ℃冰箱中保存，用于VOCs的GC-MS分离鉴定.

1.3 GC-MS分离鉴定

色谱条件：Agilent 7890B-7000D (美国 Agilent Technologies Inc.)，非极性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温50 ℃；升温程序：5 ℃/min，升温至200 ℃，然后以10 ℃/min的速率升温至300 ℃并保持6 min；载气为氦气，流量1 mL/min；进样量2 μL，不分流.

质谱条件：EI离子源，离子源温度230 ℃，进样口温度280 ℃，四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV，质子扫描范围35～400 m/z；发射电流100 μA，电压1.4 kV.

1.4 数据处理

采用Agilent 7000D质谱仪进行数据采集，Agilent MassHunter Qualitative Analysis软件解析质谱图，NIST MS Search Program软件进行化合物检索.

2 结果与分析

2.1 不同海拔贯叶连翘乙酸乙酯萃取液GC-MS分离鉴定

不同海拔贯叶连翘地上部分乙酸乙酯萃取液GC-MS分离与鉴定结果如图1和表1所示.3个海拔共分离鉴定100个化合物，其中1 000、2 300和2 800 m分别鉴定出55、52和47个化合物.前人研究结果表明，这100个化合物中有36个已在贯叶连翘中被分离鉴定.

图1 不同海拔贯叶连翘地上部分乙酸乙酯萃取液GC-MS色谱图Figure 1 Chromatography of ethyl acetate extracts from aerial parts of H.perforatum at different elevations by GC-MS

如表1所示，3个海拔共同拥有16个化合物，分别为：No.15、No.24、No.32、No.43、No.46、No.58、No.60、No.61、No.65、No.70、No.71、No.74、No.87、No.90、No.92和No.96.在1 000 m海拔，含量较高的5个化合物依次为No.58 (15.99%)、No.79 (13.83%)、No.96 (9.66%)、No.36(5.61%)和No.60 (5.52%)；在2 300 m海拔，含量较高的5个化合物依次为No.96 (16.46%)、No.58 (10.60%)、No.77 (6.68%)、No.92 (4.82%)和No.72 (3.88%)；在2 800 m海拔下，含量较高的5个化合物依次为No.96 (12.43%)、No.78 (8.11%)、No.15 (7.94%)、No.58 (5.00%)和No.67 (4.94%).通过对3个海拔化合物的差异进行比较，发现有25个化合物仅存在2 800 m或相对含量随着海拔升高而增加，分别为No.78、No.15、No.67、No.95和No.89等.

表1 不同海拔贯叶连翘地上部分乙酸乙酯萃取液的GC-MS分离鉴定

2.2 不同海拔贯叶连翘正丁醇萃取液GC-MS分离鉴定

不同海拔贯叶连翘地上部分正丁醇萃取液GC-MS分离鉴定结果如图2和表2所示，3个海拔共分离出59个化合物，其中，1 000、2 300和2 800 m分别鉴定出27、22和35个化合物.前人研究结果显示，这59个化合物中有25个已在贯叶连翘中被分离鉴定.

由表2可知，3个海拔共同拥有8个化合物，分别为No.4、No.5、No.13、No.19、No.30、No.38、No.45和No.58.在1 000 m海拔，含量较高的5个化合物依次为No.5 (41.19%)、No.46 (12.47%)、No.30 (11.45%)、No.58 (6.23%)和No.2(4.51%)；在2 300 m海拔，含量较高的5个化合物依次为No.5 (54.96%)、No.1 (16.37%)、No.55 (3.72%)、No.58 (2.92%)和No.29 (2.53%)；在2 800 m海拔，含量较高的5个化合物依次为：No.5 (27.55%)、No.48 (12.29%)、No.58 (10.69%)、 No.2 (5.20%)和No.43 (5.05%).通过对3个海拔之间化合物的差异进行比较，发现有20个化合物仅存在2 800 m或相对含量随着海拔升高而增加，分别为No.48、No.43、No.45、No.36和No.26等.

图2 不同海拔贯叶连翘地上部分正丁醇萃取液GC-MS色谱图Figure 2 Chromatography of n-butanol extracts from aerial parts of H.perforatum at different elevations by GC-MS

表2 不同海拔贯叶连翘地上部分正丁醇萃取液的GC-MS分离鉴定

续表2 Continued table 2

2.3 不同海拔贯叶连翘乙酸乙酯和正丁醇萃取液VOCs种类相对含量的比较

通过对表1和表2中3个海拔分离鉴定化合物种类进行分析，发现地上部分共分离鉴定出127个化合物，32个共同化合物；对2种萃取液中化合物相对含量计算与分析后表明，海拔对地上部分挥发性化合物的积累具有显著影响；其中，乙酸乙酯萃取液中挥发性化合物的总相对含量随海拔升高而降低，2 800 m相对2 300和1 000 m分别降低1.25和1.31倍；然而正丁醇萃取液中挥发性化合物的总相对含量在2 300 m最低，均约为1 000、2 800 m的1/2.2种溶剂萃取液中总VOCs的相对含量也在2 300 m最低，分别较1 000、2 800 m降低1.4和1.2倍(图3).

3 讨论

很多研究已表明，海拔显著影响植物的生长发育及其代谢产物的合成与积累[25-27].研究发现，海拔平均每上升100 m温度降低0.6 ℃，光照强度增加4.5%,直接辐射增大5.6%，无霜期缩短[28-29].李永升等[30]报道称，贯叶连翘喜阳光充足、温和凉爽的气候，生态适应性较强(耐寒、耐旱和耐湿)，野生植株在海拔800～2 100 m的区域均有发现，在我国山东、河北、陕西、四川、甘肃等地区均有分布与种植栽培.

图3 不同海拔贯叶连翘地上部分乙酸乙酯和正丁醇萃取液挥发性化合物总相对含量比较Figure 3 VOCs total relative content of ethyl acetate and n-butanol extracts from aerial parts of H.perforatum at different elevations

研究表明，环境因素对贯叶连翘地上部分次生代谢产物的合成与积累具有显著影响.Brunáková等[31]和Yao等[13]研究发现，适宜的低温(-4～15 ℃)相对高温(25～30 ℃)有利于主要活性组分金丝桃素和伪金丝桃素的积累；Bruni等[32]和Saeb等[33]研究发现紫外辐射或增强光照有利于主要活性组分金丝桃素、伪金丝桃素和金丝桃苷以及挥发性化合物(α-Pinene、Myrcene、Cineol、Tridecane和Phytol)的积累；Bruni等[32]通过增加土壤含水量提高了地上部分金丝桃素的积累量.在海拔影响次生代谢产物积累研究方面，Tocci等[34]研究发现，高海拔(453 m)相对于低海拔(68 m)有利于主要活性组分槲皮甙的积累，然而不利于金丝桃甙的生物合成；李云等[35]通过对不同产地海拔贯叶连翘中金丝桃素积累量进行比较，发现金丝桃素的干重含量随海拔升高(980～1 450 m)呈下降趋势.

本研究在3个海拔(1 000、2 300、2 800 m)贯叶连翘地上部分共分离鉴定127个化合物，发现海拔对非极性和极性化合物种类和相对含量具有显著影响，在乙酸乙酯和正丁醇萃取液分别鉴定出的100和59个挥发性化合物中，分别有发现有25和20个化合物仅存在2 800 m或相对含量随着海拔升高而增加.很多学者已研究发现，海拔对其它植物中挥发性化合物种类和含量也具有显著的影响，比如，烤烟在不同海拔(200～1 000 m)范围内挥发性香气化合物种类与相对含量受海拔显著影响，总体表现为提高种植海拔有利于烟叶燃吸品质的提升[36]；当归不同海拔(1 400～2 850 m)根茎中有11个挥发性成分存在较大差异，其中7个被鉴定为差异特征性化合物[37]；圆柏在5个不同海拔高度(2 800～3 200 m)叶中挥发性成分也存在较大差异，其中，单萜及其含氧化合物含量随海拔升高而降低，而倍半萜及其含氧衍生物含量则随海拔上升呈升高趋势[38].众多研究表明，海拔对植物代谢产物的合成与积累是综合因素(如物种差异、光、温、水等)影响的结果[25,26,27].对于本研究海拔影响贯叶连翘中挥发性化合物合成与积累的机制，还需要通过基因组和代谢组学等技术进行深入的研究与分析.

4 结论

本研究在3个海拔(1 000、2 300、2 800 m)贯叶连翘地上部分共分离鉴定127个化合物，发现海拔对非极性和极性化合物种类和相对含量具有显著影响.