张 抒 王梦蕾 郑益志

银屑病是一种炎症性皮肤疾病，具有顽固性和复发性的特点。姜黄素已被证明具有抗炎、抗菌、抗氧化和抗肿瘤的特性，在银屑病、白癜风等皮肤疾病中得到广泛应用[1-2]。研究发现，银屑病患者皮损组织中有近百种微小RNA（miRNA）表达上调，上调水平2～42 倍不等，其中miR-203 表达量升高最明显[3]。本研究使用外源性血管内皮生长因子（VEGF）预处理HaCaT 细胞，模拟银屑病角质形成细胞的过度增殖状态[4]。检测不同浓度姜黄素作用的HaCaT 细胞增殖情况及经VEGF、姜黄素及两种联合干预后细胞miR-203 表达的改变情况，观察姜黄素对HaCaT 细胞增殖及细胞内miR-203 表达的影响，探讨其治疗银屑病的可能机制。

1 实验材料

1.1 细 胞 HaCaT 细胞由浙江中医药大学庞艳阳博士惠赠。

1.2 药物与试剂 姜黄素（批号130823）、CCK-8 试剂盒（批号130926）美国Sigma 公司；VEGF（批号83572）英国Abcam 公司；0.25%含EDTA 胰酶（批号27250）、磷酸盐缓冲液（PBS 缓冲液）（批号20012）杭州吉诺生物技术公司；1640 培养基（批号30809.01）美国Hylcone 公司；胎牛血清（批号140112）杭州四季青公司；无水乙醇（分析纯AR）（批号2005786）无锡晶科化工有限公司；二甲基亚砜（DMSO）（批号131115） 天津天河化学试剂厂；Prime ScriptTMRT Master Mix（Code No.RR036A）（Perfect Real Time）试剂盒、Mini BEST Universal RNA Extraction Kit（Code No.9767） 日本Takara 公司；Ultra SYBR Mixture（Low ROX）（批号CW0957C）北京康为世纪公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 仪 器 生物学安全台（SW-Ⅱ-A/B3）上净净化设备有限公司；二氧化碳培养箱（3111）、生化培养箱（MIP-150）、低温高速离心机（CL31R）美国Thermo Forma 公司；倒置生物显微镜（XPS-18）重庆重光实业有限公司；电子天平（AL204/01） 上海Mettler Toledo 公司；手掌式离心机（LX-100）海门其林贝尔仪器制造有限公司；多模式酶标仪（EnSpire）美国Perkin Elmer 公司；7900 HT 高通道荧光定量PCR仪美国ABI 公司；BioPhotometer Plus 核酸蛋白定量测定仪美国Eppendorf 公司。

2 实验方法

2.1 姜黄素溶液配制 取姜黄素粉末25mg，溶于0.5mL DMSO 中，均匀振荡，待到完全溶解后加入无水乙醇至5mL，均匀振荡，配置成浓度为5mg/mL 的储存液，分装后，-20℃冰箱避光保存备用。临用前用含0.1%胎牛血清的DMEM 培养液稀释成目标浓度工作液。

2.2 CCK-8 法检测HaCaT 细胞增殖情况 将对数生长期的HaCaT 细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，接种于96 孔板，外圈各孔用无菌PBS 溶液填充；当细胞长满板底70%时，吸去原培养液，用含25ng/mL VEGF[5]的DMEM 培养液干预24h（37℃，5%CO2条件下，下同）；吸去原培养液，观察细胞，每孔给予100μL 用DMEM 培养液稀释的浓度分别为0、19.5、39、78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000ng/mL 的姜黄素溶液，每组浓度设6 个复孔，培养24h；96 孔板弃旧液，无菌PBS 溶液清洗一次后，每孔加入100μL 实验试剂（含10μL CCK-8 溶液和90μL DMEM 培养液），在培养箱中培养1h，使用酶联免疫检测仪450nm 测定吸光度值（OD 值）。

2.3 实时荧光定量PCR（real-time PCR）法检测经VEGF、姜黄素及两种联合干预后细胞miR-203 表达改变情况

2.3.1 细胞铺板及加药 将对数生长期的HaCaT 细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，接种于6 孔板；当细胞长满板底，约80%时，吸去旧培养液，根据CCK-8 实验结果设计实验分组：2mL 含0.1%胎牛血清的DMEM 培养液（空白组）、25ng/mL VEGF 溶液、5000ng/mL 姜黄素溶液、1380ng/mL 姜黄素溶液、5000ng/mL 姜黄素溶液与25ng/mL VEGF 联合溶液，1380ng/mL 姜黄素溶液与25ng/mL VEGF 联合溶液，继续培养24h。

2.3.2 设计合成引物 查阅文献得出具体序列如下[6]：miRNA-203 上游引物5'-GTCGTACCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAGT -3'，miRNA-203 下游引物5'-GCCCGTGAAATGTTTAGGACCAC-3'，hGAPDH 上游引物5'-TCTCTGCTCCTCCTGTTCGA-3'，hGAPDH 下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。以hGAPDH 为内参，检测miRNA-203 的相对表达量。

2.3.3 HaCaT 细胞总RNA 提取 遵照Prime ScriptTMRT Master Mix Code No.RR036A （Perfect Real Time）试剂盒说明书。取出6 孔板，显微镜下观察细胞生长情况，吸去旧培养液，无菌PBS 溶液清洗一次后，每孔加入200μL 裂解液，室温静置2min；加入等体积的70%乙醇，移液枪轻轻吹打使溶液均匀混合；立即将混合液移入含2mL Collection Tube 的RNA Spin Column 中，12000r/min 离心1min，弃滤液后将RNA Spin Column 放回2mL Collection Tube 中；在RNA Spin Column 中加入500μL Buffer RWA，12000r/min 离心30s，弃滤液；加入600μL Buffer RWB，12000r/min 离心30s，弃滤液，此操作再重复一遍；将RNA Spin Column 重新安置回2mL Collection Tube 上，12000r/min 离心2min；取出RNA Spin Column 置于1.5mL 的RNase Free Collection Tube上，在RNA Spin Column 膜中央处加入30μL 65℃的RNase Free dH2O，室温静置5min；以12000r/min转速离心2min 洗脱RNA，即可获得实验所需样本。

2.3.4 反转录反应 采用NanoDropND-1000 紫外分光度计测量总RNA OD260/280；配制RT 反应液（冰上进行），每个样本按10μL 反应体系配置：5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）2μL，Total RNA 10μL 的反应体系最大可使用到500ng的总RNA，RNase Free dH2O 补足到10μL。轻轻混匀之后放入仪器进行反转录反应，反应条件如下：（反转录反应）37℃15min；（反转录酶的失活反应）85℃5s；4℃。转录后所得cDNA 可直接用于realtime PCR 反应，也可-20℃保存。

2.3.5 Real-time PCR 反应 PCR 反应体系：于冰上将以下试剂依次加入八连管各孔中，每组设置3 个复孔。50μL 反应体系如下：2×UltraSYBR Mixture（Low ROX）25μL；上游引物（Forward Primer）1μL；下游引物（Reverse Primer）1μL；Template DNA 2μL；ddH2O up to 50μL。PCR 反应程序：预变性 95℃10min；变性95℃15s；退火/延伸60℃1min；变性和退火/延伸步骤重复35～40 个循环；融解曲线分析95℃15s、60℃1min、95℃15s、60℃15s。实验重复3 次。计算方法：miRNA-203 相对表达量采用2-△△Ct 方法[7]，△△Ct=△Ct-Avg.△Ct=（Ct miRNA-203-Ct hGAPDH）-Avg.（Ct miRNA-203-Ct hGAPDH）。

2.4 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（） 表示，CCK-8 法结果采用回归分析Probit 法，Real-time PCR 法多组间均值比较采用单因素方差分析，总体均值比较采用welch 检验，两两比较采用Dunnett 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HaCaT 细胞增殖情况 姜黄素在0～5000ng/mL内浓度依赖性抑制HaCaT 细胞增殖，2500ng/mL 的姜黄素对HaCaT 细胞有明显的抑制作用（P＜0.05），计算出半数抑制浓度IC50=6390ng/mL。最终选取5000ng/mL 和1380ng/mL 姜黄素溶液分别作为高浓度组和低浓度组对模型细胞进行干预。见表1。

3.2 Real-time PCR 结果 各组miR-203 表达水平均值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与空白组比较，HaCaT 细胞在25ng/mL VEGF 溶液干预刺激下miR-203 的表达明显上调（P＜0.05）；高浓度组5000ng/mL 姜黄素溶液能够明显下调HaCaT 细胞miR-203 表达（P＜0.05），而低浓度组1380ng/mL 姜黄素溶液则无明显差异（P＞0.05）；高浓度组5000ng/mL姜黄素溶液同样能够下调VEGF 诱导下HaCaT 细胞中miR-203 的表达（P＜0.05），见表2。

表1 不同浓度姜黄素对HaCaT 细胞增殖的影响（）

表1 不同浓度姜黄素对HaCaT 细胞增殖的影响（）

注：与0ng/mL 姜黄素比较，aP＜0.05

表2 各组HaCaT 细胞miR-203 表达水平比较（）

表2 各组HaCaT 细胞miR-203 表达水平比较（）

注：VEGF 为血管内皮生长因子；与空白组（浓度为0ng/mL）比较，aP＜0.05；与VEGF 组比较，bP＜0.05

4 讨论

银屑病是由多基因遗传决定、多环境因素刺激诱导、免疫功能异常性慢性炎症性皮肤病，诸多因素相互作用致使皮肤角质形成细胞增殖和分化异常、新生血管形成和炎症细胞浸润[8]。miR-203 通过调控翻译水平抑制细胞因子信号抑制剂-3（S0CS-3）的表达，是银屑病炎症持续状态的原因[9]，干预miR-203介导的细胞内信号通路可能为治疗银屑病的一种新途径。miR-203 是近年来发现的第一种皮肤特异性miRNA，特异性表达于角质细胞和皮肤上皮细胞，不但参与调控胚胎期表皮分化、构建皮肤保护层，且与靶基因共同作用参与细胞的增殖分化、侵袭转移和凋亡等[10]。miR-203 的过表达可明显降低细胞的增殖，诱导细胞的凋亡[11]。姜黄素被认为具有调节诸多信号分子生物活性的潜力，在银屑病的治疗中发挥了积极作用[12]。而姜黄素的安全性，耐受性和无毒性高剂量也已通过人体临床试验确认[13]。本实验选取0、19.5、39、78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000ng/mL的浓度梯度进行研究，发现姜黄素在实验浓度范围内呈浓度依赖性抑制HaCaT 细胞增殖，2500ng/mL姜黄素明显抑制细胞增殖（P＜0.05）。与空白组比较，miR-203 在25ng/mL VEGF 诱导下的HaCaT 细胞中表达明显上调（P＜0.05），而5000ng/mL 姜黄素能明显抑制HaCaT 细胞中miR-203 的表达（P＜0.05），同样能下调25ng/mL VEGF 刺激干预下HaCaT 细胞中miR-203 表达（P＜0.05）。推测姜黄素通过下调miR-203 表达来干预miR-203 介导的细胞内信号通路，从而达到治疗银屑病目的。