王德望，彭丽红，龚金梅，司明远，刘 梦，欧阳聪，张梦迪

冷冻切片技术已广泛应用于术中病理诊断，高质量的冷冻切片技术对确保术中病理诊断的可靠性至关重要[1-2]。目前，国内外对于术中冷冻制片的研究较多，有关冷冻后组织处理的研究较少。冷冻后组织行常规制片常常会出现形态学失真性改变，这是临床病理工作中普遍性难题[3]。作者发现冷冻后的组织经常规10%中性福尔马林固定24 h左右或更长时间后制片，易发生组织收缩过度，细胞间或组织间出现人工裂隙，细胞核过度收缩，腺源性组织尤为明显，增加了诊断难度。尤其是术中行快速冷冻病理检查的组织标本小，病变不典型，术中诊断较困难，且冷冻后对应石蜡组织(以下简称：冷对组织)为唯一组织块时，因组织过度收缩，比术中快速冷冻切片更不易观察、诊断。作者近3年通过反复实践后发现，改良冷冻后组织的固定方法可有效缓解组织过度收缩的问题，现将经验分享如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集2016年8月～2019年3月南京同仁医院病理科存档的术中行快速冷冻病理检查的部分实性或囊实性标本合计200余例，重点回顾性观察其中经石蜡切片证实的60例甲状腺乳头状癌和20例肺腺癌。

1.2 主要设备低温恒温冷冻切片机、全自动组织脱水机、漂烘仪、切片机等。

1.3 试剂配制10%中性福尔马林；AAF液(无水乙醇85 mL，冰醋酸5 mL，40%甲醛15 mL)。

1.4 方法

1.4.1常规固定方法 将术中行快速冷冻病理检查后的冷冻组织置于10%中性福尔马林中隔夜固定后，再常规脱水，该方法作为本实验中的对照方法。改良固定方法1(以下简称：方法1)：将术中行快速冷冻病理检查的冷冻组织置于预冷的AAF液中4 ℃冰箱中过夜固定，再常规脱水。改良固定方法2(以下简称：方法2)：将术中行快速冷冻病理检查的冷冻组织置于10%中性福尔马林中常温固定3 h以上，10 h以内，即送检当天适当固定后，再行常规脱水。

1.4.2实验分组 实验1组，选取最大径0.5 cm以上的肿物，取2块组织分别行快速冷冻病理检查后，再分别行常规方法及方法1固定；实验2组，选取最大径0.5 cm以上的肿物，取2块组织分别行快速冷冻病理检查后，再分别行常规方法及方法2固定。

1.4.3观察方法 所有组织块经常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察实验1、2组的甲状腺乳头癌各30例，肺腺癌各10例(经常规石蜡切片验证)。

2 结果

实验1组中27例经方法1处理的甲状腺乳头状癌组织形态优于经常规固定处理的同源组织标本，具体表现：常规固定处理的标本经常规制片后，甲状腺滤泡出现变形，拉伸感，细胞间人工裂隙明显，细胞及胞核收缩，胞核透亮空泡状特征不明显(图1)，而方法1处理的甲状腺乳头癌标本组织变形轻微，拉伸感消失或缓解，组织间人工裂隙消失或缓解，细胞及胞核收缩不明显，核透亮、空泡状(图2)。3例甲状腺乳头癌组织经方法1处理后组织形态与常规固定处理后的同源组织无明显差异性改变。10例经方法1处理的肺腺癌组织形态优于经常规固定处理的同源组织标本，具体表现：常规固定处理的标本经常规制片后，癌灶处肺泡间隔因组织收缩致增宽看似不明显，肺泡壁癌细胞核明显收缩，同时因细胞质收缩，导致部分本来连续性贴壁生长的癌细胞看似非连续(图3)，而方法1处理的肺癌标本，病灶区肺泡间隔增宽现象明显，贴壁型生长区域肺泡壁癌细胞形态饱满，呈连续性贴壁生长，核凸向肺泡腔(图4)。

实验2组中28例经方法2处理的甲状腺乳头状癌组织形态(图5)优于经常规固定处理的同源组织标本(图6)，表现结果同实验1组，2例无明显差异性改变。9例经方法2处理的肺腺癌组织形态优于经常规固定处理的同源组织标本，表现结果同实验1组，1例无无明确差异性改变。

3 讨论

通常我们认为10%中性福尔马林在组织处理过程中主要起到蛋白固定的作用，对组织的收缩作用比较弱，组织固定时间一般在6～24 h之间，最长不宜超过72 h，普遍认为，过长时间固定会造成组织抗原性丢失，一般不导致组织收缩过度，而导致组织形态变形失真[4]。但作者发现，组织冷冻后常温下10%中性福尔马林固定时间如果大于10 h，制片后组织形态会失真，主要表现为：组织过度收缩，细胞间出现人工裂隙，细胞体积变小，核变致密，核型不清晰。这些改变会导致病变出现“人工不典型”，个别情况下如果病变组织小，术中快速冷冻病理检查已全部取材或近似全部取材，因其它原因术中不能明确诊断的情况下，而冰对组织的“人工不典型”可能进一步增加诊断的难度，而不利于最终的诊断。因此，根据本科室长期以来的观察经验，传统观点所认为的10%中性福尔马林组织收缩性弱可能仅限于常规组织固定后的经验总结，而冷冻后的组织经10%中性福尔马林固定后收缩效果则不完全一致。

冷冻组织经AAF液(无水乙醇，冰醋酸，福尔马林)4 ℃冰箱中过夜固定后的制片效果较常规固定后佳，原因主要有两个方面：(1)4 ℃低温固定是关键所在，有专家认为组织经低温冷冻后(18～22 ℃)细胞内易产生冰晶，同时细胞内骨架及生物膜相系统会骤然发生改变，而冷冻切片后如直接回到室温，细胞骨架及生物膜相系统易致损伤[5-6]，而4 ℃环境可作为一个缓冲，有效缓解组织因忽“冷”忽“热”所致的损伤，但目前有关低温冷冻后组织的损伤机制尚不完全清楚，还有待得到进一步的科学论证。(2)AAF液中固定剂配伍有一定奥妙，此三种液体均有组织固定作用，但固定的机制不完全一致，其中乙醇属于凝固固定剂，其渗透性较强(比福尔马林弱)，但组织收缩性强，主要用于糖原及高分子量蛋白质固定；福尔马林属于非凝固交联固定剂，其渗透性较强，固定均匀，组织收缩性小，主要通过与蛋白质共价结合并促进蛋白质交联而产生固定作用；乙醇福尔马林混合液可保存像糖原这样的分子，使组织收缩和变硬程度比单独使用要小。乙酸属于酸性固定剂，渗透性强，其组织膨胀性强，可凝固核酸，是染色质的良好固定剂，但不能使蛋白质固定和沉淀。因此，AAF液的配方可阻抗组织过度收缩[7]，同时4 ℃固定可防止细胞内骨架及生物膜相系统受到破坏，维持细胞结构的完整性。有研究表明，甲醇与乙醇的固定效果类似，而且甲醇比乙醇的组织收缩性更少[8-10]，如果将本组实验中AAF液配方中的乙醇改成甲醇或许更佳。

总体来讲，冷冻组织经改良固定处理后形态较常规固定者佳，甚至色泽也较之鲜艳，形态色泽较接近常规非冷冻组织，虽仍有差别，但形态已相对较为保真，易于观察、诊断。在日常工作中，作者将所有行术中快速冷冻病理检查的组织均进行了改良固定和常规固定的比对，发现几乎所有的冷冻组织(鳞状上皮、腺上皮、软组织等)经改良固定后制片的效果比常规固定佳，其中以腺源性标本差异性大，究其机制不甚清楚，估计其细胞内微细结构较其他组织具有一定差异性。当然，影响冰对组织制片质量不仅仅与冷冻后固定方法这一单一因素有密切关系，还与冷冻过程中包埋剂对组织是否覆盖完全及冷冻时长等造成细胞内冰晶形成的因素密切关联。与其同时本组实验发现，组织冷冻后再固定，固定时长似乎要比常规组织固定要短，但仍需积累大样本实验进一步验证和探究。

①②③④⑤⑥