杜秋瑶，张云峰，王继芬，王 璐，常 靖，董林沛，吴小军，刘冰洁

(1.中国人民公安大学 侦察学院，北京 100038; 2.公安部 物证鉴定中心，北京 100038;3.农业农村部 环境保护科研监测所，天津 300191; 4.SCIEX 亚太应用支持中心，北京 100015)

由于农药暴露和某些慢性疾病存在关联，农药引起的健康问题日益受到关注，但是，在临床和法医病理学的实际工作中，经常碰到因意外、自杀或刑事犯罪引起的农药中毒等[1-3]。因此，不仅食品和环境中农药残留量的测定很重要，而且疑似含有农药的血液等人体生物样品中农药的快速定性定量分析也很重要[4-9]。测定血液中农药含量的方法主要有气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法、免疫分析法和高分辨质谱法等[10-11]。四极杆-飞行时间(Q-TOF)质谱作为一种高分辨率质谱，具有高质量精度、高灵敏度、高扫描速率和宽线性范围等特点，常应用于多目标物的定性定量分析和未知物的筛查中[12-17]。

本工作以常见的110种农药为目标化合物，包括58 种有机磷类农药、17 种拟除虫菊酯类农药、15种氨基甲酸酯类农药、18种除草剂、2种其他农药(昆虫生长调节剂类杀虫剂噻嗪酮和低毒性杀菌剂三唑酮)，结合超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF/MS)定性定量分析疑似血样中的目标化合物，旨在建立血液样品中多农药快速筛查和定量分析的方法，以期为法医毒物检验提供技术参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Acquity型超高效液相色谱仪;5600 Q-TOF型飞行时间质谱系统，配DuoSpray TM 离子源;Milli-Q 型超纯水系统;DHC-16500 型台式高速离心机;Vortex-Genie 2型可调速涡旋混合器;空白血来自首都医科大学附属复兴医院。

110种农药混合标准溶液:100 mg·L－1，介质为甲醇。

混合标准中间溶液和混合标准溶液系列均由混合标准溶液用甲醇逐级稀释制得。

基质匹配工作溶液由混合标准中间溶液用空白血的提取溶液稀释制得。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸、甲酸铵均为高效液相色谱级;试验用水为超纯水。

以上所有试剂均需在－20 ℃的黑暗环境中密封储存。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Kinetex Biphenyl 色谱柱(100 mm×3.0 mm，2.6μm)，柱温40 ℃;流 量0.5 mL·min－1;进样量为3 μL。流 动 相:A 为5 mmol·L－1甲酸铵溶液，B 为含5 mmol·L－1甲酸铵的甲醇溶液。梯度洗脱程序:0～0.6 min时，初始流动相B 为4%;0.6～1.2 min时，流动相B 由4%升至42%;1.2～2.2 min时，流动相B由42%升至62%;2.2～7.2 min时，流动相B 由62%升至82%;7.2～10.2 min时，流动相B 由82% 升至85%;10.2～10.4 min时，流动相B 由85%升至95%B;10.4～13.2 min时，流动相B 由95%升至99%;13.2～15.6 min时，B为99%;15.6～15.8 min时，B 由99%降 至4%;15.8～19.2 min 时，B 为4%。

2)质谱条件 电喷雾离子源正离子(ESI＋)模式;喷雾电压5 500 V;离子源温度550℃;雾化气压力379 225 Pa;辅助气压力344 750 Pa;气帘气压力241 352 Pa;碰撞气压力48 265 Pa;去簇电压60 V。采集模式:信息依赖采集(IDA)，先进行一级质谱扫描，然后基于预定义的IDA 标准自动触发二级质谱扫描，在碰撞能量(CE)为(35±15)eV 时，采用动态背景扣除(DBS)功能自动扣除背景离子，即可获得目标化合物的一级和二级质谱信息。其中，一级质谱参数:质量数扫描范围100～800，累积时间0.2 s;二级质谱参数:质量数扫描范围50～800，累积时间0.05 s。在试验开始前，应对仪器进行正向校准，直至质量误差的绝对值在2‰以内且分辨率大于30 000。进样过程中每隔5 个样品进行一次自动校正。

1.3 试验方法

在2 mL 离心管中，加入200μL 血液样品和1 000μL甲醇，混合均匀，涡旋振荡2 min，以12 000 r·min－1转速离心10 min，上清液按照仪器工作条件测定。

1.4 定性和定量分析

采用Analyst、Peak View、Master View、Library View 和Multi Quant软件进行仪器控制、数据采集和处理。根据化合物一级精确质量误差、差异同位素比、二级质谱碎片离子和谱库的相似程度，结合提取离子流色谱图的保留时间对化合物进行定性分析;采用Multi Quant软件对目标化合物进行定量分析[18]。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

液相色谱条件对于目标化合物分离是否能获得良好的色谱行为和电离起着关键作用[19-21]。试验考察了以甲醇、乙腈作为有机相，在流动相中加入不同浓度的甲酸铵和甲酸时对目标物的色谱峰峰形和色谱分辨率的影响。结果表明:以5 mmol·L－1甲酸铵溶液(A 相)-含5 mmol·L－1甲酸铵的甲醇溶液(B相)作为流动相体系时，110种目标化合物均可获得较好的峰形和色谱分辨率。试验还对梯度洗脱程序进行了优化，优化结果见1.2节中的色谱条件。在优化的色谱条件下，110种目标化合物均可在20 min内获得较好的峰形和色谱分离效果。100μg·L－1混合标准溶液的提取离子流(XIC)色谱图见图1。

2.2 基于谱库的定性筛查和确认

Master View 软件可自动进行定性分析，包括靶向和非靶向筛查，其中，二级碎片谱的与谱库中已知化合物的二级碎片的匹配度对于阳性结果的确认尤为重要，两者越匹配，得分越高，假阳性率越低，定性结果越准确。定性筛查的规则为:质量误差的绝对值小于2‰，保留时间误差小于0.5 min，差异同位素比小于10%，谱库相似程度大于80%，以上4个因子所占比重分别为30%，30%，10%，30%。软件自动计算各项得分及综合得分，当综合得分高于80分时，软件中的交通灯显示为绿色，表明化合物已成功得到定性筛查[22-23]。

图1 110种农药的提取离子流色谱图Fig.1 XIC chromatogram of the 110 pesticides

以100μg·L－1空白血提取溶液配制的混合标准溶液为试验对象时，110种目标农药碎片的定性筛查数据见表1。

表1中1～58，59～75，76～90，91～108，109～110号对应的化合物分别属于有机磷类、拟除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、除草剂和其他农药;M 为目标化合物的分子式。

表1 110种农药碎片的的定性筛查数据Tab.1 Data of qualitative screening of the 110 pesticide fragments

表1 (续)

表1 (续)

表1 (续)

以亚胺硫磷和胺菊酯为例，其一级质谱图和二级质谱图见图2和图3。

2.3 定量分析

2.3.1 工作曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件对1，2，5，10，20，50，100，200μg·L－1的基质匹配工作溶液进行测定，以110种农药的质量浓度为横坐标，其对应的色谱峰面积为纵坐标绘制工作曲线。110种农药的线性回归方程和相关系数见表2，其线性范围为5～200μg·L－1，相关系数均不小于0.99。

图2 亚胺硫磷的一级质谱图和二级质谱图Fig.2 Spectra of MS and MS2 of phosmet

图3 胺菊酯的一级质谱图和二级质谱图Fig.3 Spectra of MS and MS2 of tetramethrin

以3倍信噪比(S/N)计算110种目标农药的检出限(3S/N)，所得检出限为2μg·L－1;以10倍信噪比(S/N)计算110种目标农药的测定下限(10S/N)，所得测定下限为5μg·L－1。

以上结果说明该方法的灵敏度可以满足实际工作的测定要求[24]。

表2 110种农药的线性回归方程和相关系数Tab.2 Linear regression equations and correlation coefficients of the 110 pesticides

表2 (续)

2.3.2 精密度和回收试验

以空白血为基质，按照仪器工作条件进行了50，100，200 g·L－1等3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平重复测定6次，计算110种目标化合物的回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)，所得结果见表3。

表3 110种农药的精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery of the 110 pesticides(n＝6) %

表3 (续) %

表3 (续) %

由表3可知:110种农药的回收率为80.3%～120%，RSD 为1.9%～20%，说明该方法有良好的重复性，可用于多组分农药分析。

2.3.3 基质效应

按照试验方法分析混合标准溶液和空白基质配制的相同浓度的混合标准溶液，以两者中各农药的峰面积的比值评估基质效应(ME)，当比值不小于100%时，目标农药表现为基质增强效应，小于100%时，表现为基质抑制效应，110种农药基质效应结果见表4。

表4 110种农药的基质效应Tab.4 Matrix effects of the 110 pesticides %

表4 (续) %

由表4 可知:110 种目标农药的基质效应为80.65%～119.86%，其中59%的目标农药表现为基质增强效应，41%表现为基质抑制效应，为保证方法的准确性和可靠性，定量分析时应考虑方法的基质效应[25-26]。

2.4 样品分析

2019年9月，甘肃省某地发生了一起疑似妻子在丈夫的食物中投放农药致丈夫死亡的案件，本单位按照试验方法分析了死者血液样品，检出了敌敌畏、毒死蜱、氯氰菊酯等3种农药，质量误差分别为－1.8‰，－0.1‰，－0.1‰，保留时间误差分别为0.10，0.32，0.39 min，差异同位素比分别为7.6%，8.9%，8.5%，谱库相似程度分别为99.7%，98.5%，89.5%，综合得分分别为89.8，91.3，89.4分，质量浓度分别为183.98，156.79，104.67μg·L－1，结果与服下农药的结果一致。

2019年6月，甘肃省某地某女子因不堪忍受丈夫家庭暴力而服农药自杀，本单位根据试验方法分析了死者血液样品，检出阿特拉津、氯氟氰菊酯和克百威等3种农药，质量误差分别为0.6‰，－0.3‰，0.4‰，保留时间误差分别为0.21，0.17，0.08 min，差异同位素比分别为4.3%，7.5%，6.2%，谱库相似程度分别为97.6%，95.3%，92.8%，综合得分分别为93.7，94.5，92.1分，质量浓度分别为144.57，165.32，138.91μg·L－1，检出结果和服下农药的结果一致。

本工作建立了UPLC-Q-TOF/MS用于同时筛查、确认和定量分析血液中的110种农药的方法，该方法快速、灵敏，为临床和法医毒理学中多未知目标物的筛查提供了高效可靠的技术手段。