何娥英 胡中盛 殷久和 孙蒙蒙*

1.安徽沪谯医药有限公司，安徽 亳州 236800；2.亳州市沪谯药业有限公司，安徽 亳州 236800

女贞子为木犀科植物女贞的干燥成熟果实。其最早记录在《神农本草经》，性凉，味甘、苦，归肺、肝、肾经，主要产收于我国浙江、安徽、湖南、江苏等地[1-2]，果实一般在冬季成熟，采收时除去枝叶，然后放入沸水中略微烫后或者放于锅中稍蒸，干燥。女贞子的最初炮制见于宋代“饭上蒸”(《疮疡》)；其次，明代有用酒、旱莲草及地黄制(《蒙荃》)、酒浸蒸晒(《通玄》)、酒拌黑豆蒸九次(《打法》)、酒拌(《醒斋》)、酒蜜拌蒸暴露七日夜(《瑶函》)等方法[3]。

中药女贞子中主要活性成分之一是环烯醚萜类化合物，以裂环环烯醚萜类为主，主要化合物包括女贞苷、特女贞苷等[4]。女贞子中的红景天苷具有调节免疫、抗炎等作用，特女贞苷具有抗肿瘤作用，女贞苷 G13 具有抗骨质疏松作用[5-6]。HUANG X J 等[7]首次从女贞子中分离得到 1α 构型环烯醚萜，并解释了该化合物成分的生物合成途径，进一步丰富了女贞子中环烯醚萜类化合物的种类。女贞子生品中环烯醚萜类化合物特女贞苷含量较高，使其保肝利胆、抗肿瘤、降血脂等作用显著，酒制后，由于特女贞苷在高温和水蒸气条件下不稳定，水解生成苯乙醇类化合物红景天苷，增强了女贞子抗心肌缺血、抗肝、肾纤维化的作用，女贞子酒制后滋补肝肾作用显著与炮制过程中环烯醚萜类成分发生水解转化关系密切[8]。通过肖薇等[9]对女贞子生品、醋制女贞子、盐制女贞子和酒制女贞子的研究分析，比较反相高效液相色谱中不同炮制规格女贞子的有效成分齐墩果酸和特女贞苷进行含量对比，结果显示生品女贞子和3种不同炮制品中齐墩果酸有效含量高低顺序为女贞子生品<醋制女贞子<盐制女贞子<酒制女贞子。3种不同炮制方法得到的样品和生品女贞子中特女贞苷含量排列顺序为醋制女贞子<酒制女贞子<生品女贞子<盐制女贞子，说明女贞子的不同炮制方法对其主要有效成分齐墩果酸和特女贞苷的含量具有一定程度的影响。使用数控蒸煮锅为蒸制设备采用L9(34)的正交实验设计[10]，以有效成分特女贞苷的含量和酒蒸后女贞子外观质量为检测指标，找出适合酒制女贞子的生产工艺参数。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器 赛默飞U300高效液相色谱仪(检测器：紫外检测器)、SK8200B型数控超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)、GB/T26497型万分之一分析天平(奥素斯仪器有限公司)、DZKW-4型电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)、万能高速粉碎机(上海道宏商贸有限公司)、数控中药蒸煮锅(康华制药机械有限公司)。

1.2 药品与试药 特女贞苷对照品(批号为39011-92-2)供含量测定用；甲醇为一级色谱纯(天津四友)；水为纯化水；稀乙醇为分析纯；女贞子药材购于安徽省滁州市皇浦药材栈；黄酒采购于亳州市恒硕发酵制品有限责任公司，酒精度数≥10 Vol。

2 实验方法

2.1 特女贞苷含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：依利特Hypersil ODS2 250 mm×4.6 mm，5 μm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：甲醇—水(40∶60)；检测波长：224 nm。流速：1.0 mL/min；柱温：25℃。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取特女贞苷对照品适量于容量瓶中，加入甲醇配制成每毫升含0.25 mg特女贞苷的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称定粉碎后的女贞子药材粉末(过三号筛)0.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定重量，连接冷凝管加热回流1 h，放凉，再次称定重量，用稀乙醇补足减少的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即可得到制备的供试品溶液。

2.1.4 样品测定 分别精密吸取供试品溶液10 μL与对照品溶液5 μL，注入液相色谱仪中，按照4.1.1高效液相色谱法的测定的条件，测定，然后计算女贞子药材中特女贞苷的含量[4]。

2.2 方法学考察

2.2.1 标准曲线的绘制 分别精密量取 4.1.2 所制备的特女贞苷对照品溶液各1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL注入高效液相色谱仪中按照高效液色谱法进行测定，记录各个不同进样体积下测得的特女贞苷的峰面积数值，横坐标为进样量(μg)、纵坐标为峰面积，用特女贞苷标准曲线数据绘制标准曲线图，确定线性范围。由图1、图2可知特女贞苷标准曲线回归方程为：y=790.45x+31066，R2= 0.99762,说明进样量在0.2954～1.4770 μg线性良好。

2.2.2 精密度实验 精密量取 4.1.2 所制备的特女贞苷对照品溶液5 μL，重复进样5次注入高效液相色谱仪中按照高效液色谱法测定，记录特女贞苷的峰面积，并计算RSD值小于3 %，说明特女贞苷含量测定方法精密度良好。

2.2.3 重现性实验用分析 天平精密称取粉碎后的酒女贞子药材粉末(过3号筛)0.5 g，平行称取5份，按照上述供试品溶液制备方法，制备所需要的供试品溶液，用高效液相色谱法测定，进样10 μL。计算RSD和特女贞苷的平均含量。

2.2.4 稳定性实验 取粉碎后的女贞子药材粉末0.5 g，按照上述供试品溶液制备方法，制备所需要的供试品溶液，然后用高效液相色谱法测定特女贞苷的含量在供试品溶液中的含有量，每次间隔一个小时进样一次，连续进样9次，记录峰面积积分，测得特女贞苷含量，计算RSD值小于3 %，说明特女贞苷含量测定中供试品溶液在8 h之内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率实验 取已测得特女贞苷含量平均值为3.160 %的女贞子药材，粉碎后过3号筛，平行称取5份粉末，每份约0.5 g，5份粉末中各加入精密称定的特女贞苷对照品1 mL，依照《中国药典》(2015年版)有关供试品溶液制备的方法，制备供试品溶液，按照高效液相色谱法测定供试品溶液中特女贞苷的含量，记录峰面积，计算分析加样回收率平均值为98.2%，RSD=0.8105%。

3 实验结果

3.1 单因素考察试验 本实验考察润法中闷润时间对女贞子药材性状的影响，称取女贞子药材4份每份100 g，加相同稀释倍数的黄酒，分别闷润0.5 h、1 h、1.5 h、2 h，观察女贞子药材性状。蒸法中蒸制温度以及蒸制时间对药材性状的影响，分别称取女贞子药材4份，每份100 g，蒸制温度分别为100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃，蒸制时间分别为4 h、6 h、8 h、10 h，观察药材性状。干燥法中不同干燥温度对药材性状的影响，干燥温度分别为阴干、60 ℃、80 ℃、100 ℃，观察药材性状。见表1。

由表1可知，闷润时间以1 h为宜；酒蒸后女贞子的外观性状与蒸制时间和蒸制温度存在显著性的影响；药材的性状与干燥温度不存在显著性影响，考虑生产成本与效率选择在80℃下干燥。

表1 单因素考察药材性状表

3.2 正交试验

3.2.1 正交试验设计 按照《中国药典》(2015年版)关于女贞子药材的炮制是依照酒炖法或酒蒸法使酒吸尽或蒸透，蒸得的药材显黑褐色或灰黑色，闻之有酒香气，有的上面还附白色的粉霜，但是没有确切的规定蒸制所需要的时间。部分文献报道的蒸制时间有2 h、3 h、4 h、6 h、8 h，甚至有3 d者[11]。调查研究发现，酒蒸女贞子的质量与闷润时间、加酒量、蒸制时间、蒸制温度、干燥温度存在很重要的关系，且蒸制时间在4 h以上，才能满足《中国药典》(2015年版)对女贞子炮制的规定标准[12]。实验选取闷润时间、蒸制时间、蒸制温度和干燥温度作为4个主要考察因素，各设定3个水平，采用L9(34)正交设计表进行正交实验。因素水平见表2。以特女贞苷含量为考察指标。取净女贞子一定量共9份，按表7设计依次进行试验，试验结果见表3。

表2 正交试验因素水平表

3.2.2 正交试验结果及分析 由表3通过R值比较可知，影响酒制女贞子的最关键因素是蒸制时间，次要因素是拌黄酒后的润制时间，最次要因素为蒸制温度和干燥温度。综合酒制女贞子成品的外观性状和特女贞苷的含量(以干燥品计)，优选出最佳的生产工艺条件为A1B2C2D2，即拌黄酒后闷润1 h，蒸制温度110 ℃，蒸制时间8 h，80 ℃下干燥。

表3 酒制女贞子正交工作安排及试验结果

4 讨论

本研究考察了酒女贞子炮制过程中的润制、蒸制和干燥的指标性成分的变化，采用单因素试验、正交试验等方法优选最佳工艺。

性状变化方面，女贞子经酒蒸后颜色较原药材加深变为黑褐色或灰黑色，可能的原因是女贞子中含有的特女贞苷为环烯醚萜苷类，易水解，苷元聚合而变黑造成的。

指标成分变化方面，随着润制时间、蒸制时间和蒸制温度的增加，特女贞苷含量逐渐降低，原因是特女贞苷含有红景天苷母核，其性质不稳定，在高温作用下可使其水解生成次级苷——红景天苷，进一步水解生成红景天苷的苷元——酪醇。

炮制过程中参数控制方面，需要重点关注润制时间和蒸制时间。润时间过长会引起女贞子果皮破裂，可能也会影响女贞子有效成分含量，润时间过短会有干心，果皮稍硬，酒浸不透。蒸制时间过长女贞子呈黑褐色或灰黑色，但有效成分含量可能会降低，蒸制时间过短，药材性状达不到规定要求。而干燥温度对药材性状影响不大。

5 结论

本研究的目标是为确定酒制女贞子的生产工艺参数，实验以特女贞苷含量和酒蒸后女贞子成品外观性状为指标，通过比较得出，酒女贞子的最佳工艺参数为，拌黄酒后润1 h，110 ℃蒸制8 h，停止加热，焖一夜，出锅，80 ℃下干燥。研究过程中，结合实际生产经验设定符合酒女贞子炮制的关键节点进行考察，通过科学的实验设计进行参数优选，并在炮制终点判断时关注性状变化和指标成分含量变化的平衡，特别是性状的判断贯穿整个考察过程，在此基础上，结合特女贞苷的含量变化，确保炮制所得的酒女贞子性状和均含量符合中国药典的要求。所得工艺参数可行性良好，适合大生产操作。