禄美云

(昆明市食品药品检验研究院 药品检验中心，云南 昆明 650100)

明目地黄丸是中成药中成分较为复杂的一种，原质量检测标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准 中药成方制剂：第9册》，但该标准中只有茯苓、当归和山药这3味药的显微鉴别．之后，又收载于《中华人民共和国药典》[1]2015版(以下简称《中国药典》)中，在该药典中明目地黄丸的处方是由熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、白芍、煅石决明等12味药组成，其具有养肝明目的功效，临床用于肝肾虚、视物畏光、模糊不清等病症的治疗．其中：马钱苷为酒萸肉中的主要药效成分，具有调节免疫、抗炎和抗休克等药理作用[2-6]；牡丹皮具有清热散淤之功效，而丹皮酚为其主要有效成分之一；芍药苷有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、镇痛、镇静等作用[7-9]，是白芍和牡丹皮的主要成分．结构式见图1～图3．

《中国药典》不仅将明目地黄丸中的酒萸肉、白芍、牡丹皮3味药中的主要药效成分马钱苷、芍药苷、丹皮酚作为指标性成分，并对其含量进行测定，进而对明目地黄丸的质量进行控制，同时还规定：本药品含酒萸肉以马钱苷计算，含牡丹皮以丹皮酚计算，含白芍和牡丹皮以芍药苷计算，且大蜜丸每丸中上述3种成分分别不得少于2.0，3.6，5.4 mg．由于这3种药效成分的极性相差较大，因此《中国药典》采用3组色谱条件分别对明目地黄丸中马钱苷、芍药苷、丹皮酚的含量进行测定，所用方法操作复杂、费时．此外，还有采用在线二维柱切换-超高效液相色谱法测定明目地黄丸中莫诺苷、马钱苷、芍药苷及丹皮酚含量的报道[10-12]，这种方法虽然分离效率较高，但实验需采用两种类型的色谱柱，导致操作复杂．因此，为简化明目地黄丸(大蜜丸)中有效成分的含量测定方法，本文通过优化检测条件，实现只采用1套色谱条件，1次进样分析，就可同时定性分析及定量测定3种有效成分的含量，从而建立了一种快捷、高效的测定方法．

由于上述3种中成药成分的物理、化学性质相差较大，其中：马钱苷易溶于水，较少溶于乙醇；芍药苷在碱性条件下不稳定，而在酸性条件下稳定；丹皮酚易溶于甲醇．因此《中国药典》采用不同的提取溶剂和条件对酒萸肉、白芍、牡丹皮中3种有效成分进行提取，导致操作费时[13-15]．综合分析以上3种成分的性质，本文选择50%的甲醇为供试品中3种成分的提取溶剂和对照品的制备溶剂[16]，通过大量实验探索优化出不同于《中国药典》和其他文献的色谱条件及方法，对明目地黄丸中3种主要药效成分同时提取，提高了样品前处理的效率，并简化了3种有效成分样品提取步骤．通过一系列实验验证，证明所用方法准确、精密，具有实际应用价值，可用于明目地黄丸(大蜜丸)的质量控制．

1 仪器与试药

1.1 仪器

实验所用主要仪器如表1所示．

表1 主要仪器

1.2 试药

实验用试剂与试药见表2．

表2 试剂与试药

2 实验部分

2.1 色谱条件

色谱柱Eclipse XDB-C18(5 m，4.6 mm×250 mm)，流动相A(0.1%磷酸水溶液)-B(乙睛腈)，流量为 1.0 mL/min，马钱苷、芍药苷的检测波长为236 nm，丹皮酚的检测波长为274 nm，柱温35 ℃，进样量5 μL(自动进样器)．在此检测条件下，各待测组分分离度符合要求，马钱苷、芍药苷、丹皮酚的出峰时间分别为10.08，16.41，43.81 min．相应的理论塔板数按马钱苷、芍药苷、丹皮酚计算应分别不低于4 000，4 500，3 500．流动相梯度和检测波长见表3和表4．

表3 流动相梯度程序

表4 波长检测程序

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品马钱苷13.32 mg、芍药苷12.95 mg和丹皮酚10.42 mg分别于25 mL容量瓶中，以50%甲醇为溶剂定容，摇匀，再取定容后的马钱苷和丹皮酚对照品溶液2 mL、芍药苷对照品溶液5 mL，二次定容到50 mL容量瓶中，制成每1 mL中含马钱苷21.14 μg、丹皮酚16.65 μg、芍药苷49.57 μg的混合溶液，混合溶液用一次性针头式滤器(孔径0.45 μm)过滤，取滤液，采用自动进样器进样5 μL进行分析．

2.3 供试品溶液的制备

取明目地黄丸(大蜜丸)，剪碎，分别精密称定8份，每份1 g，置具塞锥形瓶中，并精密加入50%甲醇25 mL，密塞后称定质量，平均分成4份，分别加热回流45，60，75，90 min，放冷后称定其质量，并用50%甲醇补足减失的质量，滤过后续滤液用孔径为0.45 μm的一次性针头式滤器过滤，取滤液，采用自动进样器进样5 μL进行分析．

2.4 线性关系考察

按2.2项下制备5个不同质量浓度的混合对照品溶液，分别进样5 μL，再按2.1项下的色谱条件进样测定，记录色谱图．以对照品质量浓度、峰面积分别为横坐标和纵坐标，并进行线性回归，结果见图4、图5、图6，线性关系见表5．

表5 3种有效成分的线性方程与线性范围

2.5 精密度实验

取混合对照品溶液，连续进样6针，每针 5 μL，记录各目标成分峰面积．得到马钱苷、芍药苷、丹皮酚的峰面积的RSD值分别为0.19%，0.30%，0.59%，表明仪器的精密度良好，能满足实验定量分析的要求．

2.6 重复性实验

取同一批号明目地黄丸(大蜜丸)供试品24 g，按照2.3项下制备样品6份，进样分析，记录各目标成分峰面积，并计算各成分的质量分数．得到马钱苷、芍药苷、丹皮酚质量分数的RSD值分别为0.91%，0.39%，0.44%，表明3种有效成分质量分数测定的重复性符合《中国药典》要求(待测定成分质量分数在0.1%以内，重复性要求RSD≤3%)．

2.7 稳定性实验

取制备好的同一份供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h吸取5 μL，按2.1项下色谱条件进样测定．在上述6个时间段内，溶液中的马钱苷、芍药苷、丹皮酚的峰面积稳定，RSD分别为0.85%，1.20%，0.67%，表明该供试品溶液至少可稳定24 h．

2.8 准确度实验

使用加标回收率考察准确度．精密量取已知质量浓度的同一样品6份(每份3 mL)置25 mL量瓶中，分别精密加入2.2项下制备好的混合对照品溶液0.8，1.0，1.2 mL，定容，进样5 μL进行测定，计算回收率，加标回收率的计算公式为：加标回收率=[(实际测定值-试样测定值)/加标量]×100%．由表6～表8可见，3种有效成分质量浓度测定的准确度符合《中国药典》要求(待测定成分质量分数在0.1%以内，回收率限度在90%～108%)．

表6 马钱苷的回收率实验结果

表7 芍药苷的回收率实验结果

表8 丹皮酚的回收率实验结果

2.9 样品提取时间优化

取明目地黄丸(大蜜丸)，剪碎，分别精密称定8份，每份1 g，置于具塞锥形瓶中，并精密加入50%甲醇25 mL，密塞，称定其质量，以两份为单位平均分成4份，每份加热回流45，60，75，90 min，放冷，然后称定其质量，用50%甲醇补足加热回流过程中减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液用一次性针头式滤器(孔径0.45 μm)过滤，取滤液，采用自动进样器进样5 μL进行分析，记录色谱图．结果表明，提取60 min即可完全提取，且其最终各成分的含量符合《中国药典》规定．提取结果见表9，色谱图见图7、图8．

表9 样品提取时间及筛选结果

2.10 样品实际测定结果

本实验采用明目地黄丸(大蜜丸)(云南腾药制药股份有限公司：批号161240)，平均每丸质量9 g．按《中国药典》的规定，最终测得每丸中马钱苷、芍药苷及丹皮酚的含量，结果见表10．

表10 每丸中马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量

3 讨论

3.1 色谱柱选择

本实验在条件筛选时，曾采用XTERRA RP-C18(18.5 μm，4.6 mm×150 mm)色谱柱进行检测分析，然而用短柱分析时，马钱苷、芍药苷、丹皮酚的出峰时间分别为5.702，9.602，31.563 min，出峰时间太短，易导致对照品和样品的峰型不符合要求．此外，丹皮酚由于受到流动相酸性的影响，导致供试品峰不能与杂峰完全分离．最主要的是马钱苷、芍药苷、丹皮酚的理论塔板数不能达到《中国药典》规定的数值，只有改用长柱才能满足分析的需要, 因此本实验选用 Eclipse XDB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱．

3.2 检测波长选择

《中国药典》关于明目地黄丸的含量测定是，马钱苷的检测波长为236 nm，芍药苷的为230 nm，丹皮酚的为274 nm．而本实验采用可变波长程序，3种有效成分的检测波长仍用《中国药典》的规定．在实验中，筛选出波长改变时间程序，在该色谱条件下马钱苷、芍药苷、丹皮酚的峰形和分离度均较好，无杂峰的干扰．

3.3 溶剂提取方法选择

本实验采用加热回流提取方法，以50%的甲醇为溶剂，对45，60，75，90 min这4个时间段逐一考察．结果表明，60 min的提取效果较好，在此时间段内样品的主峰与杂峰分离度很好．

3.4 柱温选择

分别考察柱温35 ℃和40 ℃对样品测定的影响，结果显示，温度对测定结果的影响较小，因此选择柱温为35 ℃．

3.5 流动相筛选

考察流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，其比例分别为V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=12∶88、V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=15∶85和V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=20∶80．而流动相的比例对样品的测定影响较大，当V(乙腈)∶V(0.1%磷酸溶液)=15∶85为流动相时，马钱苷、芍药苷、丹皮酚与杂质峰的分离度最佳，且峰形最好．因此，本实验采用该流动相．

4 结语

1)实验结果表明，通过加热回流可有效提取明目地黄丸中的马钱苷、芍药苷和丹皮酚，且供试品的前处理较简便，在所建立的流动相和色谱条件下，无杂峰影响，能满足明目地黄丸中相关成分含量测定的基本要求．

2)《中国药典》中采用3套不同的色谱条件测定明目地黄丸中马钱苷、芍药苷、丹皮酚的含量，操作费时且样品前处理较繁琐．而本文建立了1套可以同时测定3种有效成分的色谱条件，此色谱条件主要是针对《中国药典》中3种成分的提取溶剂、供试品前处理方法和检测波长进行改进，改进后的操作方法简便、高效、节省时间、准确度高．因此，所建立的方法可用于明目地黄丸中马钱苷、芍药苷、丹皮酚的含量测定．