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上海虹口区2017-2019 年致泻性大肠埃希菌耐药和分子分型(PFGE)研究

2020-09-15倪春苗张静沈静金宏飞唐漪灵王姗

医药前沿 2020年15期
关键词:虹口区大肠分型

倪春苗 张静 沈静 金宏飞 唐漪灵 王姗

(上海市虹口区疾病预防控制中心 上海 200080)

致泻性大肠杆菌是一种重要的腹泻病病原菌,主要包括肠粘附性大肠杆菌(EAEC),出血性大肠杆菌(EHEC),产毒性大肠杆菌(ETEC),致病性大肠杆菌(EPEC),侵袭性大肠杆菌(EIEC),由它们引起的各类腹泻很大程度地影响着的人类健康,而一旦疏于监控,暴发严重疫情,会对公共卫生造成巨大威胁。为此,现将2017 年—2019 年上海市虹口区分离到的致泻性大肠杆菌进行脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型及药敏性分析,通过其PFGE 型别特征和耐药特点,为临床用药和制定有效防控措施提供依据。

1.方法与实验

1.1 样品来源

医院根据《上海市腹泻病监测试点实施方案》,采集标本后,保存于Cary-Blair 运送培养基,按生物安全运送要求于采样当天送至监测实验室。

1.2 试剂与仪器

麦康凯培养基(科马嘉);双糖(科马嘉);检测试剂盒:肠粘附性大肠杆菌(EAEC),出血性大肠杆菌(EHEC),产毒性大肠杆菌(ETEC),致病性大肠杆菌(EPEC),侵袭性大肠杆菌(EIEC)检测试剂盒,(之江生物有限公司)药敏板:革兰氏阴性菌药敏板GN4F(ThermoFisher)蛋白酶K(TaKaRa);限制性内切酶Xba Ⅰ(TaKaRa)

PCR 仪:宏石实时荧光PCR;水浴培养箱(天能科技);浊度仪(法国生物梅里埃);生物安全柜(美国Baker);GFL 型水浴摇床;凝胶成像系统和PFGE及配套设备(美国Bio-Rad公司)。全自动微生物药敏鉴定仪(Sensititre)

1.3 致泻性大肠埃希菌检测、分离及鉴定参照《上海市腹泻病监测试点实施方案》

标本直接麦康凯(MAC)平板上,36 度培养18 ~24h,挑取5 个可疑菌落进行生化初筛。生化初筛符合后进行荧光定量PC R检测(上海之江科技公司)确证实验。;反应体系:检测混合液35μl,酶0.4μl,H2O1μl,样品4μl。条件:37℃2m,94℃2m,再按93℃15s ~60℃s,进行40 个循环),反应体系40μl。实验结果判定按照检测试剂盒说明书。PFGE 分型按照美国CDC PulseNet 制定的PFGE 标准,沙门标准菌株H9812 作为分子质量标记,选用限制性内切酶Xba Ⅰ进行酶切。PFGE 图像用BioNumerics 软件根据UPGMA 方法进行聚类分析。实验参数:电压梯度6V/cm,电场夹角120°,脉冲时间6.76 ~35.38s,电泳时间18±1h。

1.5 药敏检测

确认致泻性大肠杆菌的菌株进行肉汤增菌,用比浊仪调到0.5 麦氏单位,在全自动药敏鉴定仪上按照操作规程完成加样、判读.

2.结果

2.1 致泻性大肠在2017 年送检318 份样品,2018 年133 份样品2019 年10 为止是170 份,一共为621 份。在这些感染性腹泻患者粪便标本中,检出85 株致泻性大肠,检出率为13.68%,其中EPEC(30 株)ETEC(41 株)和EAEC(14 株)。

2.2 对80 株菌株做了PFGE 分子分型检测、

其中2017 年44 株,2018 年5 株(2018 年收集的菌株样本比较少,)2019 年31 株。在2017 年出现2 株ETEC 菌株100%的聚类和2019 年出现了2 株EAEC 菌株100%的聚类。其他每个带型仅有1 株菌。PFGE 条带型相似性60%~ 100% 分型结果表明本区致泻性大肠呈高度多态性。如图1

2.3 对60 株菌株做了药敏检测,采用了MIC 法

共做了24 种抗生素的药敏实验,致泻性大肠杆菌对美罗培南(MEM)、亚胺培南(IMP)、阿米卡星(AMI)多粘菌素E和B(CT、PB)完全敏感;对氨苄西林(AMP)、四环素(TET)耐药率高分别为70%和60%,对头孢烯类抗生素(CTX、CEC、CFX、CAZ)中、只有22.%的菌株对CFZ 耐药,其他均敏感。对氨基糖苷类抗生素(KAN、GEN)绝大多数菌株敏感。

3.讨论

3.1 在621 份粪便标本中,检出85 株致泻性大肠,检出率为13.68%,与国内相关报道基本符合[1-2]。

3.2 近年来,由于抗生素的广泛使用,致泻性大肠杆菌耐药性问题日益严重,已经出现了许多多重耐药菌株[3]而虹口地亚安培南(IMI)、美罗培南(MEM)、阿米卡星(AMI)多粘菌素E 和B(CT、P B)完全敏感;孢烯类抗生素(C TX、CEC、CFX、CAZ)中、只有22.%的菌株对CFZ 耐药,其他均敏感。对氨苄西林(AMP)、四环素(TET)耐药率高分别为70%和60%,对氨基糖苷类抗生素(KAN、GEN)绝大多数菌株敏感(这与一些地区报道不一致)[4]。所以由致泻性大肠杆菌引起的腹泻中,在治疗过程中应结合《抗菌药物临床应用指导原则》和本地区该菌耐药特点进行选择,以减少耐药株的产生。

3.3 80 株大肠杆菌出现78 个PFGE 带型,表明虹口区致泻性大肠带型呈现高度多态性,这与其他地区情况一致[5].其中在2017 年和2019 年中分别出现两株PFGE 带型中100%的聚类情况,并且耐药性也很相近,提醒相关部门关注,可能会引起小规模的暴发。。

3.4 通过药敏实验和PFGE 建立本地区的致泻性大肠杆菌基础数据库,结合临床特征、流行病学调查,深入认识虹口地区致泻性大肠杆菌分群特征及整体状况,对本地区致病性的大肠杆菌长期监测、耐药情况的发现、指导临床用药及疫情的预测预防等工作具有重要价值。

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