李娜(河南知微生物医药有限公司，河南 新乡 453000)

0 引言

阿托伐他汀钙为他汀类血脂调节药，是羟甲戊二酰辅酶(HMG-CoA)还原酶抑制剂，它主要通过抑制肝脏内HMG-CoA还原酶来降低血浆中胆固醇和血清脂蛋白的浓度。主要适应症有原发性高胆固醇血症、混合性高脂血症[1]以及纯合子家族性高胆固醇血症。此类药物具有选择性好、疗效高、副作用少等优点，是目前治疗高胆固醇症的主导药，也是心脑血管类药物中最有前景的药物[2-5]；4-氟-α-(2-甲基-1-氧丙基)-1-γ-氧-N，β-二苯基苯丁酰胺(M4)是合成阿托伐他汀钙的一个关键中间体，其有关物质A含量的高低直接影响着阿托伐他汀钙的质量。本文对其有关物质A方法进行优化，建立了合适的检测方法，该方法下杂质峰形良好，专属性强，准确度好，能有效的控制M4中有关物质A的含量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent高效液相色谱仪(DAD检测器)，梅特勒MS105电子天平，梅特勒FE28酸度计。

1.2 试药

有关物质A对照品(5-VCP-20-1，来源：TRC)；M4样品(5313-180421，5313-180424，5313-180425，来源：河南豫辰药业股份有限公司)，乙腈：色谱级，其他试剂均为分析纯，水为哇哈哈水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex F5(250×4.6mm，5μm)，柱温40℃，流动相：5mmol/L磷酸二氢钾溶液(pH3.0)：95%乙腈=45:55，流速：1.0ml/min，进样量20μl，检测波长：220nm，稀释剂：5mmol/L磷酸二氢钾溶液(pH3.0)：乙腈=50:50；

2.2 溶液配制

(1)空白溶液：稀释剂；

(2)供试品溶液：取M4样品约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加约5ml乙腈使溶解，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；

(3)对照溶液：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置20ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀；

(4)分离度溶液：取M4样品、有关物质A对照品各适量，加适量乙腈使溶解，用稀释剂稀释制成每1ml含M4约0.4mg、有关物质A约0.2μg的混合溶液。

2.3 系统适用性

按“2.1”项下色谱条件，精密量取空白溶液、分离度溶液、供试品溶液、对照溶液各20μl，分别进样测定，记录色谱图。分离度溶液中主峰保留时间10.669min，与相邻杂质峰分离度3.3，有关物质A保留时间8.743min，与相邻杂质峰分离度2.2；对照溶液连续进样6针，峰面积RSD为0.5%，理论塔板数为28700；空白溶液在M4及有关物质位置无干扰。见图1。

3 方法验证结果

3.1 专属性

取M4样品适量，对其进行酸(0.1mol/L盐酸)、碱(0.1mol/L氢氧化钠)、氧化(30% 过氧化氢)、高温(60℃)、高湿(90%)、光照(4500lx)试验考察，M4在酸、氧化、高温、高湿、光照条件下比较稳定，在碱条件下不稳定，主峰降解7%，主峰纯度为999，与相邻峰分离度为3.3，有关物质A未检出，破坏前后物料守恒值为100.5%，专属性良好。

3.2 线性考察

称取M4、有关物质A对照品各适量，加乙腈适量使溶解，用稀释剂稀释制成20%、50%、75%、100%、125%、150%限度溶液，精密量取各线性溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度(μg/ml)对峰面积进行线性回归。有关物质A和M4线性方程分别为：y=40.5085x+0.1575，y=37.8623x-0.3562，R2分别为0.9992、0.9940，计算有关物质A校正因子为0.93。结果表明，有关物质A 在0.038μg/ml～0.28μg/ml、M4 在0.041μg/ml～0.31μg/ml浓度范围内线性良好。

3.3 检测限和定量限

取“3.2”项下线性贮备液，用稀释剂逐步稀释至S/N≈10时作为定量限，S/N≈3时作为检测限。有关物质A检测限浓度为0.019μg/ml；定量限浓度为0.038μg/ml，6 针峰面积RSD 值为4.2%。

3.4 准确度

图1

取M4样品约20mg，精密称定(称取9份)，置50ml量瓶中，加约5ml乙腈使溶解，分别精密加入有关物质A贮备液(5μg/ml)1ml、2ml、3ml，相当于限度浓度的50%、100%、150%(每个浓度3份)，用稀释剂稀释至刻度，作为加标溶液；另配制每个加标溶液的自身对照溶液。按加校正因子的主成分自身对照法计算回收率，3个浓度下回收率分别为106.4%、113.6%、108.4%，RSD为4.1%，结果均在80%～120%之间，RSD小于10%，方法准确度良好。

3.5 精密度(重复性)

取M4(批号：5313-180421)供试品6份，按照“2.2”项下平行配制并测定，6份供试品溶液有关物质A均未检出，方法重复性良好。

3.6 溶液稳定性

取“2.2”项下的供试品溶液、对照溶液、分离度溶液，室温放置不同时间，分别进样测定。M4供试品溶液放置18h，有关物质A均未检出；对照溶液放置18h，峰面积RSD值为1.5%；分离度溶液放置8h，有关物质A含量变化量为0.01%，稳定性良好。

3.7 耐用性

取空白溶液、分离度溶液、供试品溶液、对照溶液(配制方法同“2.2”项下)分别在柱温±2℃、流速±0.1ml/min、波长±2nm、流动相比例±2%、pH±0.2、不同型号色谱柱(Luna PFP)条件下进行测定，各变动参数条件下，对照溶液6针峰面积RSD值最大为4.7%，分离度溶液有关物质A、M4与相邻峰分离度最小为2.0，M4供试品溶液有关物质A均未检出；方法耐用性良好。

3.8 样品测定

取M4供试品(批号5313-180421, 5313-180424, 5313-180425)，按照“2.2”项下方法配制溶液并进行测定，3批样品中有关物质A均未检出。

4 结语

(1)流动相及柱子的选择。有关物质A是M4的同分异构体，其与M4分离较差且峰形较差，故单独开发M4中有关物质A的检测方法。M4的pKa为11.5，流动相初步选择pH3.0的磷酸二氢钾缓冲液-甲醇(40:60)，色谱柱为Ajilent SB-C18，该方法下，有关物质A前伸严重；流动相更换为pH3.0的磷酸二氢钾缓冲液-95%乙腈(50:50)，有关物质A峰形明显改善，峰形良好，但与M4其他有关物质分离较差，调整流动相洗脱比例及考察Ajilent Plus-C18、EC-C18、XDB-C8柱子，分离度均无明显改善；根据M4结构特点，选用Phenomenex Kinetex F5(五氟苯基柱)，有关物质A与M4其他有关物质分离较好，故选择F5柱子。

(2)波长的选择。有关物质A经紫外扫描，其最大吸收波长为205nm，该波长下基线较差，对比220nm波长，基线良好，且满足灵敏度检测要求，故波长选择220nm。

(3)稀释剂的选择。M4及有关物质A在乙腈中溶解性较好，用乙腈作为稀释剂时，发现有关物质A峰形较差，推测有溶剂效应；稀释剂更换为乙腈-水和乙腈-pH3.0的磷酸二氢钾溶液，峰形变好，但有关物质A在乙腈-pH3.0的磷酸二氢钾溶液中较稳定，故选择稀释剂为乙腈-pH3.0的磷酸二氢钾溶液。

本研究采用HPLC法建立了阿托伐他汀钙中间体M4的有关物质A检测方法，结果表明所建立的方法准确、可靠，可用于M4的有关物质检测。控制好中间体M4的质量是确保阿托伐他汀钙有关物质含量低的重要前提。本研究对于阿托伐他汀钙原料药的生产控制具有较重要的意义。