杨 阳 ，路 姣 ，赵长琦，高文运

（1.西安医学院 药学院,陕西 西安710021;2.北京师范大学 生命科学学院，北京100875；3.西北大学 生命科学学院 国家微检测系统工程研究中心，陕西 西安 710069）

鸢尾属（Iris）是鸢尾科中最大的属。目前，全世界鸢尾属植物共计有300余种，我国约有60种，主要分布于西南、西北、东北及中部等地区。鸢尾属植物在世界的许多国家和地区被用作传统的药用植物，具有抗炎，抗菌，抗病毒等作用[1]。鸢尾属中最主要的化学成分为黄酮类，具有多样并且良好的生物活性，被认为是该属药材药效的重要物质基础之一，可作为药材的质量评价指标[2]。

膜苞鸢尾（Irisscariosa Willd.ex Link）为鸢尾科鸢尾属植物，是新疆传统中草药镰叶马蔺根的药材基源，具有清热解毒和利咽的药效。课题组首次系统研究了膜苞鸢尾的化学成分及其抗炎活性[3，4]，野鸢尾苷、野鸢尾黄素等异黄酮类成分是膜苞鸢尾的重要药效物质基础[5]，本实验建立了灵敏准确的RPHPLC测定方法，同时对从膜苞鸢尾中分离得到的野鸢尾苷、野鸢尾黄素的含量进行测定，可为膜苞鸢尾后续的质量标准研究奠定基础，对该药用植物的进一步开发利用具有一定意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Aglilent-1260系列高效液相色谱系统（包括四元梯度泵，50μL微量进样器，柱温箱和DAD二极管阵列检测器）；FA1004B电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

野鸢尾苷、野鸢尾黄素标准品为自制，其结构经质谱（MS）、核磁（NMR）确认，经 HPLC 测定，质量分数在98%以上。实验用水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。乙腈为色谱纯，H3PO4为分析纯（天津市耀华化学试剂有限责任公司）。

1.3 药材

植物材料采自新疆察布查尔锡伯族自治县，经北京师范大学刘全儒教授鉴定为鸢尾科（Iridaceae）鸢尾属（Iris）膜苞鸢尾（Irisscariosa Willd.ex Link）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 标准品溶液的制备 精密称取野鸢尾苷3.0mg，野鸢尾黄素2.8mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至50mL。再精密移取10mL于25mL的容量瓶中，用甲醇定容，作为混合标准品母液，4℃冷藏待用。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取膜苞鸢尾根茎干燥细粉（60目）1g，加甲醇100mL，索氏提取1h，滤过洗涤，合并滤液及洗涤液至250mL容量瓶中，甲醇定容，作为供试品溶液，用微孔滤膜（0.45μm）滤过后放置，4℃冷藏备用。

2.2 色谱条件

色谱柱为VenusilASB C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.5%H3PO4水溶液，流速1.0mL·min-1，检测波长269nm，柱温 25℃，进样量5μL。梯度洗脱条件见表1。膜苞鸢尾供试品和混合标准品溶液见图1。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Condition of gradient elution

图1 供试品（A）和标准品（B）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of sample（A）and reference substance（B）

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取“2.1.1”项下混合标准品母液 1，2，3，4，5mL，置 10mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列浓度混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，以峰面积积分值（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，野鸢尾苷得线性方程为Y=20.421X+2.03（r=0.9996），且质量浓度在 2.4～12μg·mL-1范围内线性关系良好。野鸢尾黄素得线性方程为Y=39.165X+1.05（r=0.9995），且质量浓度在 2.24～11.2μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度实验 精密量取2.1.1项下混合标准品适量，按照“2.2”项下色谱条件重复进样 6次，记录峰面积，计算出野鸢尾苷和野鸢尾黄素标准品峰面积积分值的RSD分别为0.33%，0.29%。结果表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性实验 精密称取同批次膜苞鸢尾根茎粉末（60目），按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，计算出野鸢尾苷和野鸢尾黄素分别为1.80mg·g-1，0.65mg·g-1，RSD 分别为 1.38%，1.80%。结果表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性实验 精密量取同一供试品溶液适量，分别于室温下放置 0、2、4、8、12、24h ，按“2.2”项下色谱条件进样测定，考察其稳定性，结果野鸢尾苷和野鸢尾黄素峰面积的RSD分为0.24%，0.33%，表明供试品溶液在室温下放置24h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率实验 精密称取已测定的膜苞鸢尾根茎粉末（60目）约1g，共6份，分别精密加入一定量的标准品，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，并按照2.2项下色谱条件进样测定，计算野鸢尾苷和野鸢尾黄素的平均回收率分别为98.45%，97.93%，RSD值分别为2.29%，3.93%。实验结果见表2。

表2 加样回收率实验结果（n=6）Tab.2 Results of Recovery Test（n=6）

2.4 样品含量测定

分别精密称取3个批次膜苞鸢尾根茎粉末（60目），按“2.1.2”项方法制备，分别进样 5μL，记录峰面积，按照标准曲线，以外标法计算，化合物野鸢尾苷和野鸢尾黄素的含量见表3。

表3 膜苞鸢尾中野鸢尾苷和野鸢尾黄素的含量测定实验结果Tab.3 Experimental results on the content determination of iridin and irigenin in Iris scariosa

3 讨论

膜苞鸢尾作为新疆中草药镰叶马蔺根的药材基源，用于治疗咽喉肿痛，音哑。但由于地理位置和经济发展水平的限制，此前未见到有关膜苞鸢尾化学成分的研究报道，本课题组首次报道了膜苞鸢尾的化学成分，其中的野鸢尾苷及野鸢尾黄素已被证实具有显著的抗炎活性，是膜苞鸢尾清喉利咽的主要功效成分，本实验首次测定了膜苞鸢尾中的两种黄酮类有效成分的含量，可为药材的质量评价提供方法学依据。

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 流动相的优化 本试验分别考察了不同的流动相体系、流动相比例对主要成分分离情况的影响[6-9]。黄酮类结构中常带有酚羟基，为了抑制其解离，克服分离时的拖尾现象，流动相中需要加入酸调节pH值。本研究考察流动相以甲醇、乙腈作为有机相，0.1%H3PO4、0.5%H3PO4、1%HAc、0.5%HAc 作为水相。结果乙腈-0.5%H3PO4水溶液梯度洗脱时基线平稳，各色谱峰峰型较好，分离效果最佳。

3.1.2 检测波长的选择 在 200～400nm进行紫外光谱扫描，化合物野鸢尾苷和野鸢尾黄素均在269nm波长处有最大紫外吸收，故选择269nm作为检测波长。

3.2 样品提取工艺的考察

以野鸢尾苷和野鸢尾黄素的提取率为指标，本实验考察了乙酸乙酯，甲醇，乙醇等3种提取溶剂对提取效率的影响，结果表明甲醇对野鸢尾苷和野鸢尾黄素的提取率均最高且峰形良好。同时考察了提取时间对实验结果的影响，结果为索式提取1h即可提取完全。

4 结论

综上，本实验采用高效液相色谱（HPLC）法测定膜苞鸢尾中的野鸢尾苷和野鸢尾黄素的含量，实验方法简单，仪器的精密度好，样品的重现性好，稳定性好，回收率率符合分析测定的要求，结果可靠准确。可以用于膜苞鸢尾中两种黄酮类有效成分的含量测定，可为膜苞鸢尾的质量控制及开发利用提供实验依据。