2016—2019年广西玉林市送检病死鸭的鸭圆环病毒检测

2020-09-07

中国动物检疫 2020年9期

（玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林 537000）

鸭圆环病毒（duck circovirus，DuCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，直径约15 nm，核酸为单股环型DNA，是目前已知最小的鸭病毒。Hattermann 等[1]研究发现，DuCV 感染造成的淋巴组织损伤导致了机体体液免疫和细胞免疫功能的下降，这种免疫抑制反应增强了其他共感染因素的致病性。施少华等[2]研究发现，大部分品种及不同日龄的鸭对DuCV 均易感。2014年粟艳琼[3]等发现，广西家禽市场健康鸭群的DuCV 平均检出率为8.01%，其中玉林市为1.36%。2016年杨晶[4]等对我国部分地区采集的302 份鸭组织样品，进行了7 种常见鸭病毒性疫病检测，结果发现DuCV 检出率高达20.2%，说明DuCV 已成为我国鸭群中的主要流行病原之一。

玉林市养殖信息报送系统提供的统计数据显示，玉林市2016—2019年鸭平均存栏量为1 170.73 万只，且鸭养殖规模逐年增长，已成为广西重要的鸭养殖基地。DuCV 常呈隐性和混合感染，感染后的临床症状不典型，需要辅助以分子生物学方法进行确诊[5]。为初步了解玉林市DuCV 感染情况，对2016—2019年部分养鸭场送检的病死鸭组织样品，通过PCR 方法进行病原检测，以期为玉林市DuCV 感染防控提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 病料样品

2016—2019年广西玉林市629 个养鸭场送检的病死麻鸭、樱桃鸭、白鸭、鬼头鸭的肺脏、胰腺、脾脏、肝脏、脑组织样品共856 份。其中，2016年137 个养鸭场送检168 份，2017年127 个养鸭场送检189 份，2018年146 个养鸭场送检196 份，2019年219 个养鸭场送检303 份（表1）。

1.2 试剂与仪器

核酸自动抽提试剂盒：购于天根公司；PCR 扩增试剂盒：购自TaKaRa 公司；琼脂糖：BIOWEST 公司产品；DL 2 000 DNA Marker：购自TaKaRa 公司。核酸凝胶成像仪：型号BioDocit 220，UVP 公司产品。高速冷冻离心机：型号CT15RT，上海天美科学仪器有限公司产品。

表1 2016—2019年广西玉林市养鸭场送检情况

1.3 引物设计与合成

根据参考文献[6]设计1 对DuCV 引物：上游引物5'-GTCGCTGGGAGGAAGAGC-3'；下游引物5'-GTAATACTTGTTTTCGGCGGG-3'。扩增片段大小为351 bp。引物均由InvitrogenTM公司合成。

1.4 PCR 扩增

PCR 反应体系（25 μL）：模板产物3 μL，上下游引物（20 mmol/L）各0.25 μL，2×PCR Master MiX 12.5 μL，ddH2O 9 μL。扩增程序[6]：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共进行35 个循环；最后再经72 ℃延伸10 min 后，于4 ℃结束反应。取5 μL PCR 产物在1.0%琼脂凝胶上进行核酸电泳，在阴、阳性对照均成立的情况下，于核酸凝胶成像仪中观察检测结果。

1.5 其他细菌及病毒检测

无菌采集病死鸭肝脏、肺脏、脾脏、胰腺组织分装，以无菌PBS 缓冲液，按质量比1:5 稀释后研磨，用高速冷冻离心机12 000 r/min离心5 min后，提取200 μL 上清液，使用核酸自动抽提试剂盒，按步骤抽提核酸。根据参考文献[8-13]中的PCR/RT-PCR 检测方法，分别进行副黏病毒、禽多杀性巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、鸭黄病毒、大肠杆菌、鸭细小病毒等6 种病原的核酸检测。

2 结果

2.1 总体情况

2016—2018年，856 份病死鸭样品中，共检出DuCV 阳性91 份，平均检出率为10.63%。2016年检出率为2.38%，2018年上升至16.33%，2019年又下降至14.52%（表2）。玉林市所有7 个管辖县（市、区）、所有品种鸭均有阳性样品被检出，其中不同县（市、区）的阳性检出率介于9.89%～20.88%，不同品种鸭的检出率介于8.79%～28.57%。

表2 2016—2019年广西玉林市病死鸭DuCV 检出情况

2.2 不同日龄

不同日龄的统计结果（表3）显示：1～20日龄的DuCV 检出率最低，为8.67%；21～65日龄检出率最高，为15.11%。

表3 各日龄段病死鸭DuCV 检出情况统计

2.3 不同月份

不同月份的统计结果（表4）显示：上年12月—2月、3—5月的DuCV 检出率较高，分别为11.88%、13.15%；而6—8月、9—11月较低，分别为4.35%、8.56%。

2.4 混合感染

对91 份DuCV 阳性样品进行细菌及其他病毒的核酸检测，发现有87 份存在混合感染，占比为95.60%（87/91）。混合感染均是DuCV 分别与禽多杀性巴氏杆菌、副黏病毒、鸭疫里默氏杆菌的双重感染，检出率分别为47.13%（41/87）、28.74%（25/87）、24.14%（21/87）。

表4 不同月份病死鸭DuCV 检出情况统计

3 分析与讨论

3.1 流行形势

检测发现，广西玉林市鸭场送检的病死鸭样品DuCV 检出率为10.63%，说明该地存在一定水平的DuCV 流行，这与施少华[2]等检测的我国部分地区病死鸭15.28%的DuCV 个体阳性率基本相符。不同地区、不同品种鸭均有阳性样品被检出，说明玉林市的DuCV 流行范围较广，对鸭养殖业影响较严重。因为本次检测的是病死鸭，所以相比粟艳琼[3]等对当地健康鸭DuCV 的个体阳性检出率1.36%有所偏高。从不同年份的统计结果来看，玉林市DuCV 感染率整体呈上升趋势，2017年DuCV 检出率较2016年上升了3.44%，2018年较2017年上升10.51%。虽然2019年较2018年下降了1.81%，但由于病死鸭检测数量有限，且未对健康鸭带毒情况进行研究，暂不能说明DuCV 感染得到了控制，仍需加强防控。

3.2 感染日龄及易发季节

从不同日龄的阳性检出率可以发现，虽然各年龄段的鸭中都有DuCV 检出，但21日龄以上病死鸭的检出率（14.25%）高于20日龄以内（7.76%），这可能与该病毒能够被鸭隐性携带有关。本次检测结果与施少华等[2]的病死鸭DuCV 检测结果基本相符。不同月份统计结果统计发现，上年12月—2月和3—5月的DuCV 阳性检出率较高，说明玉林市DuCV流行有一定的季节性特征，春冬季节高发，这可能与当地春季的“回南天”气候和冬季温度骤降过快有关。这与杨晶等[4]在我国部分地区鸭病毒性疫病流行病学调查中发现的DuCV 季节性特征相似。