黄 帅 蒋 瑞 王 强 黄梅桂

(南京林业大学轻工与食品学院食品科学与工程系1，南京 210037)(重庆第二师范学院生物与化学工程学院2，重庆 400067)

近年来，将创新提取技术应用于橄榄油的萃取中从而提高橄榄油的品质或产量已成为国内外研究的热点，这类技术主要包括在橄榄油提取过程中使用微波、超声波、热交换技术[8-10]或者在橄榄果糊搅拌融合的过程中加入滑石粉或者酶制剂来提高橄榄油的产量和质量[11, 12]。酶解法由于其高特异性和低操作温度，在橄榄油提取工业中具有较高的应用价值。在橄榄融合的过程中，酶制剂的加入可以破坏植物的细胞结构，并从细胞中释放出油脂和水。植物细胞壁主要由果胶物质、纤维素、半纤维素和木质素构成。酶能减少亲水酚与多糖的络合，增加橄榄糊中游离酚的浓度，并在加工过程中释放到油和废水中。然而，由于酚类物质的亲水性，大量的酚类物质可能会溶解在废水中，因此，总酚的变化可能与橄榄的品种有关[12]。此外，酶制剂对含有油滴的橄榄糊状胶体系统也有类似的作用(如果胶、纤维素、蛋白质等)。因此，在橄榄糊融合的过程中加入酶制剂有助于提高出油率并且提升橄榄油的品质。

目前已有研究证明在橄榄融合过程中加入酶制剂可以显著提高橄榄油的出油率[13, 14]，然而关于添加酶制剂对橄榄油脂肪酸组成、总酚及抗氧化活性影响的研究较为少见。另一方面，在橄榄提取过程中酶制剂的添加量对橄榄油品质的影响是巨大的，确定合适的酶添加量是获得高品质橄榄油的关键。因此，本研究选用重庆地区产量较稳定的豆果品种，在橄榄融合过程中加入不同剂量的酶，研究酶处理前后橄榄油质量指标、化学组分以及抗氧化活性的变化，结合相关性分析和主成分分析，确定最优的酶种类和添加量，以期为国内橄榄油的加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

油橄榄鲜果采集于重庆市合川区油橄榄种植基地，选取产量较稳定的豆果品种在油橄榄成熟初期(果皮全绿)进行手工采摘。采后24 h内提取橄榄油。

果胶酶：10 000 U/g、纤维素酶：30 000 U/g。

1.2 仪器与设备

Aglient7890A气相色谱；HP-88(100 m×0.25 mm)毛细管色谱柱；TGL-18MS高速离心机；SpectraMax i3x酶标仪。

1.3 橄榄油提取

参照Najafian等[14]的方法，橄榄油的提取步骤：1)清洗，去枝叶；2)用破碎机将橄榄粉碎获得精细的糊状物；3)将橄榄糊放入水浴中调节温度至37 ℃，并按0%、0.2%、0.5%、0.8%的添加量加入果胶酶和纤维素酶；4)使用搅拌机在150 r/min下缓慢搅拌橄榄糊45 min；5)6 000 r/min下离心20 min获得橄榄油；6)静置沉淀以获得清澈的橄榄油。收集到的橄榄油在4 ℃下避光保存。

1.4 质量指标分析

参照ISO 660—2009、ISO 3960—2001和ISO 3656—2002的方法测定橄榄油的游离酸度、过氧化值和特定波长紫外吸收(K232和K270)。

1.5 脂肪酸组成

参照GB 5009.168—2016的方法对橄榄油脂肪酸组成进行测定。

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1.6 酚类化合物的提取

酚类化合物的提取参照Xiang等[15]的方法，稍作改动，5 g橄榄油与10 mL 80% 甲醇混合，振摇1 min后4 000 r/min离心15 min，收集上层液体，重复提取三次后在40 ℃下浓缩并用80%甲醇定容至25 mL。

1.7 总酚含量的测定

通过福林酚法测定总酚含量[15]，20 μL福林酚试剂和20 μL水加入20 μL多酚提取液中，6 min后加入140 μL 10%碳酸钠溶液，摇匀，避光反应2 h后于760 nm下测定吸光度。结果以每千克油中没食子酸的含量表示(mg GAE/kg)。

1.8 总抗氧化活性的测定

1.8.1 ABTS自由基清除活性

参照Bouarroudj等[16]的方法测定ABTS自由基清除活性并稍作修改，将ABTS溶液(7 mmol/L)与过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)按1∶1混合并在室温下避光保存12～16 h以产生ABTS·+储备溶液，将ABTS·+储备溶液用乙醇稀释至734 nm处吸光度为0.70±0.02。将180 μL稀释后的ABTS·+储备溶液与20 μL酚类提取物混合，在10 min后测定734 nm处的吸光度。结果以每千克油中含有Trolox物质的量表示(μmol TE/kg)。

1.8.2 DPPH自由基清除活性

参照Angelica 等[17]的方法测定DPPH自由基清除活性并稍作修改，将180 μL DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L)与20 μL酚类提取物混合，30 min后在517 nm下测量吸光度。结果以每千克油中含有Trolox物质的量表示(μmol TE/kg)。

1.8.3 铁离子还原能力测定

参考Benzie等[18]的方法测定铁离子还原能力(Ferric Reducing Antioxidant Power, FRAP)。FRAP试剂是由乙酸钠缓冲液(pH 3.6)、TPTZ(10 mmol/L)和FeCl3·6H2O溶液(20 mmol/L)按10∶1∶1的比例混合而成。随后将20 μL 酚类提取液与180 μL FRAP试剂混合。37 ℃下反应30 min并于593 nm处测定吸光度。结果以每千克油中含有Trolox物质的量表示(μmol TE/kg)。

1.9 数据分析

所有结果均以平均值±标准偏差(SD)表示，显著性分析采用单因素方差分析(ANOVA),并进行Turkey检验比较平均值，根据质量指标、脂肪酸组成、总酚及总抗氧化活性，应用主成分分析(Principal component analysis，PCA)和相关性分析(Correlation analysis，CA)深入研究酶处理对橄榄油品质的影响以及各指标间的相关性。所有数据分析均采用SPSS 19.0。

2 结果与讨论

2.1 质量指标

橄榄油的游离酸度代表油脂中游离脂肪酸的含量，按油酸的百分比来计算，是评价橄榄油品质的重要指标之一，同时也是橄榄油分类的主要标准之一[16]。如图1a所示，所有橄榄油样品的游离酸度均在国际橄榄油理事会(International Olive Oil Council, IOOC, 2003)确定的0.8的上限内。酶在破坏细胞壁的同时会释放出游离脂肪酸，加入果胶酶和纤维素酶后游离酸度出现明显的升高，此外，由于果胶酶对细胞壁的降解作用较大，在降解细胞壁的同时能释放出更多的游离脂肪酸，因此，纤维素酶处理后橄榄油的游离酸度总体低于果胶酶处理后的橄榄油。过氧化值和特定波长紫外吸收(K232和K270)主要用于评估橄榄油的氧化状态。过氧化值代表油脂中初级氧化产物的含量，结果以每千克油中活性氧的量表示。K232和K270代表着油脂中共轭二烯、共轭三烯以及羰基化合物的含量[15]，如图1所示，所有橄榄油的过氧化值、K232和K270均在IOOC(2003)规定的范

注：添加酶种类相同时，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

围内(过氧化值：≤20 mmol/kg；K232：≤2.50；K270：≤0.20)[16]。两种酶处理后，橄榄油的过氧化值都出现下降的趋势，当纤维素酶的添加量增加到0.8%时，橄榄油的过氧化值上升至11.75 mmol/kg，显著低于未添加酶时获得橄榄油的过氧化值(P<0.05)。加酶后K232也同样表现出下降的趋势，当两种酶的添加量增加到0.8%时，K232开始上升。此外，加入纤维素酶后K270未出现明显的变化。结果表明，在融合过程中添加果胶酶和纤维素酶能有效保护橄榄油不受氧化，显著降低油中初级氧化产物和次级氧化产物。

2.2 脂肪酸组成

橄榄油的脂肪酸组成主要包括棕榈酸(C16∶0)，油酸(C18∶1)和亚油酸(C18∶2)，以及少量的棕榈油酸(C16∶1)，硬脂酸(C18∶0)和亚麻酸(C18∶3)。表1列出了加酶前后橄榄油脂肪酸组成的变化，如表1所示，油酸是橄榄油中主要的脂肪酸，具有抗氧化和降血脂的作用，并且可以预防心血管疾病。酶在降解细胞壁时释放出大量的游离脂肪酸，因此，在融合过程中加入果胶酶和纤维素酶可以显著提高橄榄油中的油酸比例(P<0.05)，在加入0.2%纤维素酶和果胶酶后，油酸比例分别提升至65.85%和64.69%，并且随着两种酶添加量的增加，油酸的比例逐渐降低。棕榈酸是橄榄油中主要的饱和脂肪酸，添加纤维素酶和果胶酶后，棕榈酸的含量显著降低(P<0.05)，在纤维素酶添加量为0.2%时，棕榈酸的比例最低，为16.40%，随着两种酶添加量的增加，棕榈酸的比例也略有上升。亚油酸和亚麻酸是橄榄油中omega-6和omega-3族脂肪酸。经两种酶处理后，亚油酸比例没有明显的变化，而亚麻酸的比例随着酶添加量的增加显著提升(P<0.05)。

表1 橄榄油样品的脂肪酸组成

2.3 总酚、总抗氧化活性及相关性分析

橄榄油中的酚类物质是评估橄榄油品质的重要指标，酚类物质可以提高橄榄油的抗氧化性，并与橄榄油的苦味有关，橄榄油中酚类物质含量越高，苦味越强烈[19, 20]。酶处理前后总酚含量的变化如图2a所示，当加入0.2%纤维素酶后，橄榄油的总酚含量略有下降，随着纤维素酶添加量的增加，橄榄油的总酚含量也逐渐增加，并在添加量为0.5%时达到最高值(139.95 mg GAE/kg)。添加0.2%果胶酶后，橄榄油中总酚含量略有上升，但并不显著(P>0.05)。随着果胶酶添加量增加至0.5%和0.8%，总酚含量出现显著提升(P<0.05)，分别为165.05 mg GAE/kg和155.05 mg GAE/kg。这是由于果胶酶和纤维素酶能有效降解橄榄细胞壁，从而提高了酚类化合物的提取。此外，酶的存在能够降低橄榄糊中多糖与酚类之间的相互作用，这种相互作用会形成能够包埋多酚化合物的复合物，被认为是果糊破碎融合过程中酚类物质损失的主要原因之一。另一方面，这种机制诱导了乳液的形成，其稳定性取决于从橄榄和水中转移到橄榄油中的内源性两亲物(如磷脂、糖、蛋白质等)。乳液的稳定性对于橄榄油的质量(包括酚类化合物)至关重要[21]。

酶处理前后橄榄油样品的抗氧化活性如图2所示，ABTS和DPPH主要用于评估化合物的自由基清除活性，而FRAP主要用于确定样品的铁离子还原能力。添加0.2%和0.8%纤维素酶后，橄榄油的ABTS抗氧化活性未出现显著变化，当纤维素酶添加量为0.5%时，ABTS抗氧化活性达到616.85 μmol TE/kg，显著高于其他样品(P<0.05)。橄榄油的ABTS抗氧化活性在果胶酶添加量为0.5%时最高，为515.14 μmol TE/kg。当果胶酶的添加量增加至0.8%，ABTS抗氧化活性未出现显著变化(P<0.05)。DPPH抗氧化活性在纤维素酶和果胶酶添加量为0.5%时最高，分别为532.40、479.60 μmol TE/kg。当加入0.2%纤维素酶时，橄榄油的总酚和DPPH抗氧化活性都出现下降的趋势，这是由于当加酶量较低时，络合在纤维素等结构中的不可提取部分酚并未得到释放，橄榄糊中游离酚的浓度增加较少，并且由于酶释放出了细胞中的水分，使得大量的亲水酚溶于废水中，因此，加入少量酶会降低总酚及DPPH抗氧化活性[6]。

注：添加酶种类相同时，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

FRAP的变化趋势与ABTS抗氧化活性相似，在两种酶添加量0.5%时，铁离子还原能力达到最大。事实上，当两种酶的添加量为0.5%时，橄榄油总酚含量与总抗氧化活性都达到最大，且总酚与总抗氧化活性呈高度相关。表2列出了各指标之间的相关性，如表2所示，总酚含量与ABTS、DPPH和FRAP呈高度相关(相关系数r分别为0.601、0.814和0.829)，并与DPPH和FRAP相关性显著(P<0.05)。而ABTS与DPPH和FRAP之间相关性呈极显著(P<0.01)，相关系数r分别为0.918和0.928，FRAP与DPPH之间也呈极显著相关(P<0.01)，相关系数r为0.947。此外，过氧化值与K232呈显著正相关(P<0.05)而与三种抗氧化活性之间呈高度的负相关，并与FRAP之间呈极显著负相关，相关系数r为-0.895。本研究的结果证明了果胶酶和纤维素酶能有效降低橄榄油中的氧化产物，并提高油脂的抗氧化能力。

表2 橄榄油质量指标、化学组成及抗氧化活性的相关性分析

2.4 主成分分析

主成分分析(PCA)是一种无监督的多元分析方法，通过降低原始数据矩阵的维数对数据进行分析。数据中提取的主成分可研究酶处理对橄榄油品质的影响，并确定哪些变量是造成差异的主要原因[22]。本研究根据油脂的质量指标、脂肪酸组成、总酚和总抗氧化活性，对酶处理前后橄榄油品质的变化进行深入分析，并对其进行分类，根据主成分综合得分计算最优的酶及添加量。主成分分析的结果如图3所示，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的累计贡献率为71.79%。其中，PC1的方差贡献率为51.38%，与亚油酸含量、油酸含量、亚麻酸含量、总酚以及总抗氧化活性呈正相关，与过氧化值和K232呈负相关。PC2的方差贡献率为20.41%，与亚油酸含量、总酚以及总抗氧化活性呈正相关，与油酸含量呈负相关。总酚、总抗氧化活性以及橄榄油氧化指标在PC1中占有较大比重，而油酸、亚油酸的含量在PC2中占有较大比重，因此，结合PC1和PC2可以更清晰的研究酶处理前后橄榄油的品质变化。如图3b所示，所有橄榄油样品可分为三类，未添加酶的橄榄油样品与加酶处理后的橄榄油样品在PC1和PC2方向上均相差较大。添加0.5%纤维素酶的橄榄油样品的总酚及抗氧化活性最高，因此其PC1得分远大于其他样品。此外，由于添加0.5%纤维素酶得到的橄榄油过氧化值和K232较低，因此添加0.5%纤维素酶能有效提高橄榄油的总酚、抗氧化活性和氧化稳定性。

注：A：未添加酶；C1：添加0.2%纤维素酶；C2：添加0.5%纤维素酶；C3：添加0.8%纤维素酶；P1：添加0.2%果胶酶；P2：添加0.5%果胶酶；P3：添加0.8%果胶酶)。

3 结论

本研究选用重庆地区产量较稳定的豆果品种，在橄榄融合过程中加入不同剂量的酶，研究酶处理前后橄榄油质量指标、脂肪酸组成、总酚以及抗氧化活性的变化。结果表明，酶处理可以有效降低橄榄油中的氧化产物，并增加橄榄油中油酸的比例。虽然酶处理后的橄榄油游离脂肪酸的含量会有小幅提升，但是所有橄榄油样品的游离酸度均在IOOC(2003)所规定的范围内。此外，果胶酶和纤维素酶能有效降解橄榄细胞壁，减少亲水酚类物质与细胞壁多糖的络合，有助于橄榄果皮中的游离酚的释放，从而提高橄榄油中总酚含量及抗氧化活性。结合主成分分析的结果，确定了在橄榄融合的过程中添加0.5%纤维素酶得到的橄榄油总酚、抗氧化活性和氧化稳定性最高。