莫静燕 黄皆竣 宋人杰

（扬子江药业集团江苏紫龙药业有限公司（质检中心） 江苏常州 213000）

1 前言

盐酸纳布啡注射剂属于临床新型吗啡类k类受体，具有止痛、镇静的作用，可于脊髓内达到最高浓度，并且该药物对血管、呼吸系统作用较小，因此广泛用于术后镇痛、小手术等[1]。产科患者使用纳布啡进行术后镇痛作用显著，可减轻术后疼痛，预防并发症[2]。目前，国内外文献报道中尚无盐酸纳布啡注射液细菌内毒素检查方法。

为了提升该制剂质控标准，本文按照2015年版《中国药典》规定，对盐酸纳布啡注射剂进行细菌内毒素方法学验证，并建立该制剂的细菌内毒素检查法，旨在为药品生产和检验监督提供可行有效的方法学参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 仪器

1384-A2 型生物安全柜（Thermo Scientific）；GCS干热灭菌柜 （山东新华医疗器械股份有限公司）；ET-96内毒素凝胶法测定仪（天津市天大天发科技有限公司）；ZH-2振荡混匀器（天津药典标准仪器厂）。

2.1.2试剂

鲎试剂（批号1903041）、鲎试剂A（批号1811212）（灵敏度0.125 EU/mL，规格 0.1 mL/支，湛江安度斯生物有限公司）；鲎试剂B（灵敏度0.125 EU/mL，规格0.1 mL/支，批号19030512，福州新北生化工业有限公司）；细菌内毒素检查用水（规格50 mL/瓶，批号1706090，湛江安度斯生物有限公司）。

2.1.3供试品

盐酸纳布啡注射液（10mg∶1mL，批号为 19060161、19060261、19060361，扬子江药业集团江苏紫龙药业有限公司）。

3 方法

3.1确定细菌内毒素限值（L）

根据2015版《中国药典》1143细菌内毒素检查法[1]，药品的细菌内毒素限值L一般按以下公式确定：

其中：L为供试品的细菌内毒素限值，EU/mg；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素计量，盐酸纳布啡注射液属于普通注射剂，故 K=5 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量[3]。

原研说明书规定：对于70 kg患者的皮下、肌肉内或静脉内给药，通常推荐的成人剂量为10 mg；必要时，该剂量可每3～6h重复一次。在非耐受性个体中，推荐的单次最大剂量为20 mg，最大总日剂量为160 mg[4]。 目前，盐酸纳布啡注射液（1 mL∶10 mg）拟在国内销售，同时为提高内控标准，人均体重按照中国人平均体重60 kg计算。

细菌内毒素限值：

3.2 干扰初筛试验[5]

3.2.1 最大有效稀释倍数（MVD）和最低有效浓度（MVC）的计算

MVD是样品的最大允许稀释倍数，在MVD下，可以判断细菌内毒素限值，该方法适用于注射液或经肠道的以溶解或稀释形式给药的药品溶液。

其中，C为供试品溶液浓度，mg/mL；L为供试品细菌内毒素限值，EU/mg；λ为鲎试剂的灵敏度，EU/mL。

根据公式（2）可计算出盐酸纳布啡注射液进行细菌内毒素检测时，使用不同灵敏度的鲎试剂所对应的MVD分别为λ=0.25 EU/mL时，MVD为100倍，MVC 为0.1mg/mL；λ=0.125EU/mL时，MVD为200倍，MVC为0.05mg/mL；λ=0.06 EU/mL时，MVD为 400倍，MVC为0.025mg/mL；λ=0.03EU/mL时，MVD为800倍，MVC为0.012 5 mg/mL。

3.2.2 初筛试验

供试品组NPC（溶液A）制备：取1批盐酸纳布啡注射液，用细菌内毒素检查用水（BET水）分别稀释100倍、200倍、400倍和800倍，使其质量浓度分别为 0.1、0.05、0.025、0.012 5 mg/mL。

供试品阳性对照组PPC（溶液B）制备：用上述梯度的BET水稀释液作为溶剂，与4λ浓度内毒素标准品等比混合的方法制备含有2λ（0.5 EU/mL）浓度内毒素的供试品。

其中，E1为内毒素浓度为1 EU/mL的阳性溶液。

细菌内毒素阳性对照组PC（溶液C）制备：取细菌内毒素工作标准品1支，逐级稀释制备成含2λ浓度的内毒素标准溶液。

阴性对照组NC（溶液D）：细菌内毒素检查用水，盐酸纳布啡注射液干扰初筛试验结果详见表1。

表1 盐酸纳布啡注射液干扰初筛试验结果

由表1结果可见，盐酸纳布啡注射液（10mg∶1mL）浓度稀释到0.1 mg/mL或以下时，鲎试剂与细菌内毒素反应未见增强或抑制的干扰作用。

3.3干扰试验

用灵敏度为0.125 EU/mL，选择湛江安度斯和福州新北2个不同厂家的鲎试剂按照2015版《中国药典》1143细菌内毒素检查法进行试验，取3批盐酸纳布啡注射液（10 mg∶1 mL）用BET水将样品逐步稀释至0.05 mg/mL，用BET水和盐酸纳布啡注射液稀释液将对应的细菌内毒素工作标准品稀释至2λ（0.25 EU/mL）、λ（0.125 EU/mL）、1/2λ（0.06 EU/mL）、1/4λ（0.03 EU/mL）浓度的 PC 系列（溶液 C）和供试品阳性对照PPC系列（溶液B），每一稀释浓度平行4管，同时用上述供试品稀释液（溶液A）和BET水（溶液D）各做2管阴性对照管，按公式计算BET水和供试品稀释液反应终点浓度的几何平均值（Es、Et），结果详见表2。

结果显示，只有当盐酸纳布啡溶液A和阴性对照溶液D的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和 Et）。 当 0.5λ≤Es≤2λ 及 0.5Es≤Et≤2Es时，供试品在该浓度下无干扰作用。若盐酸纳布啡溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复进行干扰试验。表2结果显示，将本品稀释200倍（0.05 mg/mL稀释溶液），用湛江安度斯生物有限公司和福州新北生化工业有限公司的鲎试剂试验，对内毒素与鲎试剂的反应无干扰作用，表明3批盐酸纳布啡注射液（10 mg∶1 mL）所含细菌内毒素未超过限度规定，3批盐酸纳布啡注射液（10 mg∶1 mL）的细菌内毒素检查均符合规定。

表2 盐酸纳布啡注射液干扰试验结果

4 讨论

本研究通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和盐酸纳布啡溶液中反应的差异程度，确定盐酸纳布啡注射液在某一浓度下是否对细菌内毒素检查有增强或抑制作用。

不同厂家生产的鲎试剂由于生产工艺、质量参数等方面存在一定差异，因此其抗干扰能力不同，故本试验采用了湛江安度斯和福州新北2个不同厂家共3批样品与鲎试剂的相容性进行筛查试验，确定其无干扰的浓度范围。内毒素干扰预试验结果表明盐酸纳布啡注射液为0.1 mg/mL或以下浓度稀释液时对鲎试剂无干扰作用。随后进行正式干扰试验，3批盐酸纳布啡注射液0.05 mg/mL稀释液与2个不同厂家各3个批次的鲎试剂进行干扰试验，结果对2个厂家的鲎试剂均无干扰作用，Es和 Et均在 0.5λ～2λ，表明盐酸纳布啡注射液0.05 mg/mL稀释液对以上2个厂家鲎试剂无干扰作用。

研究表明，盐酸纳布啡注射液（10 mg∶1 mL）可按2015年版《中国药典》第一法（凝胶法）进行细菌内毒素检查，确定限值为2.5 EU/mg。