张哲，于学健，曹艳花，姚粟

(中国食品发酵工业研究院有限公司,中国工业微生物菌种保藏中心，北京，100015)

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei,L.casei)作为乳酸菌中一个有重要应用价值的菌种，常作为益生菌的候选菌[1-4]，呈革兰氏阳性，不产芽胞，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶，接触酶阴性；最适生长温度为37 ℃，菌体长短不一，两端方形，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色；生化反应能发酵多种糖，可以发酵糖类产生乳酸[2,5]。其在自然界中分布广泛，是人类口腔、肠道和阴道中的正常菌种。同时也是一种应用广泛的菌种，常被应用于制备发酵乳制品和益生菌制剂，其中最为人们所熟知的就是干酪乳杆菌代田株(L.caseistrain Shirota)[6]。尽管干酪乳杆菌有着广泛的应用价值，但长期以来人们对于干酪乳杆菌及其相近菌种的分类一直存在争议。随着分类学方法和技术的不断进步，知晓干酪乳杆菌及其相近菌种的分类变迁，有助于更好地了解这一菌种及其未来在各个方面的应用[7]。

1 Lactobacillus casei(干酪乳杆菌)及模式菌株

1.1 早期干酪乳杆菌的提出

干酪乳杆菌(L.casei)相关菌株最早是在1889-1891年由VON FREUDENREICH[8]提出，并命名为Bacillusα。但根据国际命名法，该名称的后缀α不符合法律规定，所以该名称最终未能正式发表[8]。

之后ORLA-JENSEN在1919年提到了Caseibacteriumvulgare这一名称，但没有将该名称作为一个新的菌种名称有效发布[8]。ORLA-JENSEN同时还提出过Streptobacteriumcasei(S.casei)这一名称并在文章中发表，但是由于其属名Streptobacterium是链球菌，但其为乳杆菌，所以这个名称并不符合微生物命名法规，因而没有被继续使用[8]。

1.2 Lactobacillus casei的提出

L.casei这一名称最早是在HOLLAND[9]的文章中出现的，但是在该文章中HOLLAND只是把其归为乳杆菌属下的一个种，并标明ORLA-JENSEN为该名称的提出者，并没有对其进行详细描述，所以L.casei这一名称仍未在其文章中正式发表。

1923年BERGEY也在其文章中使用过L.casei这一名称[8]，在之后其他人用到该名称时，他经常被认为是L.casei的作者。但是，BERGEY并未在他的文章中提出过将L.casei作为一个新的菌种命名[8]。此外KRASILNIKOV也在文章中提到过L.casei这一名称，但该名称最终未能有效发表[8]。直到在1971年，HANSEN在文章中正式提出并有效发表了L.casei这一名称，并将ATCC 393(即ORLA-JENSEN的S.caseiNO.7)指定为该菌种的模式菌株。

1.3 干酪乳杆菌的5个亚种

干酪乳杆菌(L.casei)最初的分类有5个亚种，分别是：L.caseisubsp.casei(1916年ORLA-JENSEN，1971年HANSEN提出)[8]；L.caseisubsp.pseudoplantarum(1965年ABO-LNAGA，KANDLER提出)[10]；L.caseisubsp.tolerans(1965年ABO-LNAGA，KANDLER提出)[10]；L.caseisubsp.rhamnosus(1968年HANSEN提出)[10]；L.caseisubsp.alactosus(1973年MILLS提出)[10-11]。

1.4 关于干酪乳杆菌的模式菌株的争议

在1971年HANSEN[8]提出了干酪乳杆菌(L.casei)的模式菌株ATCC 393之后，关于干酪乳杆菌的模式菌株一直存在着争议。

在1975年DELLAGLIO等[12]进行的干酪乳杆菌亚种的DNA杂交实验中，除了NIRDC15和ATCC 15820之外的所有菌株与ATCC 393的同源性都很低，只有8%～46%。而这些菌株与ATCC 334的同源性在71%～85%。因此DELLAGLIO建议应该重新考虑是否将ATCC 393定为干酪乳杆菌的模式菌株。

1989年COLLINS等[13]进行的干酪乳杆菌DNA同源性实验也表明大多数干酪乳杆菌的菌株与模式菌株ATCC 393的同源性很低。

1991年DELLAGLIO等[14]通过DNA分子杂交试验和可溶性细胞总蛋白数值分析得出结论，干酪乳杆菌的亚种与ATCC 393的同源性都不高，但与ATCC 334在基因上十分相近。此外ATCC 393与L.rhanmosusATCC 15820(曾经L.zeae的模式菌株)DNA同源性达到80%。因此DELLAGLIO提出ATCC 334应取代ATCC 393作为干酪乳杆菌的模式菌株。但这一提议在1994年被国际细菌系统学委员会的司法委员会拒绝了[15]。

1996年DICKS[16]认为司法委员会的拒绝理由无法令人信服，DICKS对不同的干酪乳杆菌进行了随机扩增多态性聚合酶链式反应(random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction，RAPD-PCR)实验，结果表明L.caseisubsp.caseiATCC 393与其他干酪乳杆菌RAPD-PCR结果不同。他认为ATCC 393不应该作为干酪乳杆菌的模式菌株，而应该是典型的L.zeae，同时ATCC 15820也应该是L.zeae。此外ATCC 334是干酪乳杆菌的4种亚种中最具代表性的，它在基因上最适合作为干酪乳杆菌的模式菌株。

1997年MORI等[11]对干酪乳杆菌相近菌种的16S rRNA进行了比较分析，实验结果表明ATCC 334和其他的干酪乳杆菌菌株之间有相似的16S rRNA基因；ATCC 393有自己独特的16S rRNA基因，与ATCC 15820、ATCC 334以及其他的L.paracasei都不同；ATCC 393与ATCC 334、L.paracasei之间的差异比ATCC 393与L.zeae之间的差异更大。

1998年ZHONG等[17]和1999年TYNKKYNEN[18]的实验结果也都支持DELLAGLIO在1991年的结论，即ATCC 334应取代ATCC 393作为干酪乳杆菌的模式菌株。

2000年CHEN[15]对干酪乳杆菌相近菌株23S-5S rRNA基因间隔区编码基因的比较分析。实验结果表明，ATCC 393的间隔区序列不同于其他干酪乳杆菌的间隔区序列(在长度和序列异质性上都不同)，而ATCC 334与其他干酪乳杆菌的LISR(长基因间隔区长度)及SISR(短基因间隔区长度)的相似性均高于ATCC 393与其他干酪乳杆菌的相似性。这一研究结果支持DICKS在1996年提出用ATCC 334替代ATCC 393 作为干酪乳杆菌的模式菌株的建议。

2001年FELIS[19]对干酪乳杆菌的看家基因recA基因片段序列进行了比较分析，实验结果表明，在系统发育树上ATCC 393与L.zeae模式菌株ATCC 15820的距离相较于ATCC 393与ATCC 334之间的距离更近。而ATCC 334与L.paracasei之间的距离几乎为0。通过实验得到的Knue值进行比较发现，ATCC 334和ATCC 393是2个完全不同的菌种。FELIS同样认为ATCC 393不应该作为干酪乳杆菌的模式菌株，而应该是ATCC 334。

在1996-2002年的国际原核生物系统学委员会(International Committee on Systematics of Prokaryotes，ICSP)会议上[20-22]都对DICKS等的观点进行了讨论，2002年ICSP会议决定根据ICSP法规，将在之后的适当时间通过投票解决这一问题。

在2002年，DELLAGLIO等[23]再一次对ATCC 393是否应该作为干酪乳杆菌(L.casei)的模式菌株向司法委员会提出建议，他们认为，ATCC 393不应该作为干酪乳杆菌的模式菌株，因为它在基因上与干酪乳杆菌是不相符的。基因实验的结果证明，ATCC 393和ATCC 15820是同一种。而在1996年L.zeae才被正确的认识，这是导致ATCC 393被错误分类的原因。根据这些研究结果，建议把ATCC 393归为L.zeae。基于干酪乳杆菌没有合适的模式菌株，建议将ATCC 334作为干酪乳杆菌的模式菌株。2004年DOBSON等[24]的研究结果也支持DELLAGLIO的结论。

但这一建议在2008年被国际细菌系统学委员会(International Committee of Systematic Bacteriology，ICSB)的司法委员会[25]拒绝了。司法委员会认为L.casei的分类是基于ATCC 393的，而ATCC 334应该属于L.paracasei，取消L.paracasei这一分类并将其中的菌株ATCC 334作为L.casei的模式菌株这一提议不符合规范。

此外ATCC 334作为L.paracasei的菌株，不能将其认定为L.casei的模式菌株。ATCC 393仍应该是干酪乳杆菌的模式菌株，尽管它在遗传学上与ATCC 15820相近，也应该保留L.paracasei这一名称，而非恢复L.zeae这一分类名称。

2 Lactobacillus paracasei(副干酪乳杆菌)的提出及存在的争议

2.1 Lactobacillus paracasei及亚种的提出

在1989年COLLINS[14]进行的干酪乳杆菌(L.casei)DNA-DNA杂交实验中，L.caseisubsp.alactosus，L.caseisubsp.pseudoplantarum，L.caseisubsp.tolerans以及大多数的L.caseisubsp.casei的DNA之间的同源性都很高(65%～85%)，并且形成了独立的同源性组。但是这些菌株与干酪乳杆菌的模式菌株ATCC 393的同源性都较低(10%～20%)，因此COLLINS建议将干酪乳杆菌的4个亚种L.caseisubsp.alactosus，L.caseisubsp.pseudoplantarum，L.caseisubsp.tolerans以及大部分的L.caseisubsp.casei划分为一个新的独立菌种即Lactobacillusparacasei,其中包含L.paracaseisubsp.paracasei、L.paracaseisubsp.tolerans两个亚种。COLLINS在文章中也对L.paracasei及亚种进行了描述。

2.2 Lactobacillus paracasei存在的争议

L.paracasei这一分类提出后仍存在许多争议，许多学者认为ATCC 393不应该作为鉴定L.casei的模式菌株，因而L.paracasei这一分类是错误且不必要的。

1991年DELLAGLIO[14]通过DNA分子杂交试验得出结论，L.paracasei菌株在基因型上与干酪乳杆菌亚种的菌株的基因型十分相似，同源性均在75%以上，所以他建议取消L.paracasei这一分类。

1996年DICKS[16]对干酪乳杆菌及相近菌株进行的RAPD-PCR实验、1998年ZHONG等[17]对干酪乳杆菌及相近菌株进行的分子分型实验、1999年TYNKKYNEN等[18]对干酪乳杆菌及相近菌株进行的脉冲场凝胶电泳实验以及2001年FELIS等[19]对干酪乳杆菌及相近菌株的看家基因recA基因片段序列的比较分析得出的系统发育树都支持了DELLAGLIO的观点。

基于上述研究结果，在2002年，DELLAGLIO等[23]向ICSB下属的司法委员会提出取消L.paracasei这一分类，同时保留L.caseisubsp.casei和L.caseisubsp.tolerans这2个亚种的建议。该建议在2008年被司法委员会拒绝[25-26]。

3 Lactobacillus rhamnosus(鼠李糖乳杆菌)的提出

1975年DELLAGLIO等[12]对干酪乳杆菌(L.casei)的5个亚种进行了DNA分子杂交实验。实验结果表明，干酪乳杆菌的所有亚种中，除了L.caseisubsp.rhamnosus之外，其他的4个亚种之间的同源性都很高。而L.caseisubsp.rhamnosus和L.caseisubsp.casei的同源性只有33%～37%。在实验中，以L.caseisubsp.rhamnosusATCC 7469为参考菌株，实验用到的17个菌株中13个都被鉴定为L.caseisubsp.rhamnosus。此外，这些菌株与L.caseisubsp.caseiATCC 393、L.caseisubsp.caseiATCC 334、L.caseisubsp.alactosusATCC 27216和LactobacillusplantarumATCC 14917的同源性非常低。实验结果表明，L.caseisubsp.rhamnosus不应该作为干酪乳杆菌的一个亚种，而应该是一个独立的菌种Lactobacillusrhanmosus。

1989年COLLINS等[13]，对干酪乳杆菌进行了DNA同源性分析，实验结果表明L.caseisubsp.rhamnosus的菌株之间表现出高度的同源性，但与其他乳杆菌之间的同源性很低。所以COLLINS同样建议将L.caseisubsp.rhamnosus归为一个独立的菌种。

1991年DELLAGLIO[14]的实验结果再次证明了应该将L.caseisubsp.rhamnosus归为一个独立的菌种Lactobacillusrhamnosus。

由于许多研究结果都表明L.caseisubsp.rhamnosus亚种的菌株之间同源性高，而与L.casei其他亚种之间的同源性都很低。此后L.rhanmosus作为一个新菌种得到广泛的认可和接受。

4 Lactobacillus zeae(玉米乳杆菌)的提出与合并

1973年，核酸杂交技术开始用于厌氧型细菌的分类[27]。在此之前，多数细菌的分类都是依据表型分型的结果，表型分型并不能保证微生物之间的同源性。

1959年KUZNETSOV首次分离并提出了Lactobacilluszeae这一名称，并将其作为一个新的菌种。1964年KUZNETSOV将该菌种的模式菌株提交到美国模式菌株保藏中心(ATCC)，并编号为ATCC 15820。但是该名称并未在其文章中发表，与此同时发现L.zeae与L.casei十分相似[28]。

1973年MILLS和LESSEL[28]对L.caseiATCC 393和L.zeaeATCC 15820进行了核酸相关性鉴定和G+C含量测定，实验结果表明，ATCC 393与ATCC 15820除了在能否发酵鼠李糖方面不同外(ATCC 393不能发酵鼠李糖，ATCC 15820可以发酵)，其他特性均相同。核酸同源性鉴定结果为82%。G+C含量也十分相近(ATCC 15820 48%摩尔比，ATCC 393 49%摩尔比)。因此，MILLS和LESSEL认为ATCC 15820应该是归为L.casei的一个新的菌株。根据表型分析结果，ATCC 15820应该属于L.caseisubsp.rhamnosus。但根据DNA鉴定结果，ATCC 15820应该属于L.caseisubsp.casei[28]。MILLS和LESSEL对ATCC 15820究竟应该属于干酪乳杆菌的哪一个亚种没有给出明确的结论。此后对L.zeae是否应该作为一个独立菌种也争议不断。

1991年DELLAGLIO[14]通过DNA分子杂交试验和可溶性细胞总蛋白数值分析得到结果，干酪乳杆菌(L.casei)的亚种与ATCC 393 DNA的同源性都不高，但ATCC 393与ATCC 15820(曾经L.zeae的模式菌株)DNA同源性达到80%。故DELLAGLIO提出，应重新研究原本属于L.zeae的菌株，并将L.zeae划分为独立的菌种。但这一提议在1994年被ICSB的司法委员会拒绝了[20]。

1996年DICKS[16]对干酪乳杆菌(L.casei)及相近菌种进行的RAPD-PCR实验、1997年MORI等[11]对干酪乳杆菌及相近菌群的16S rRNA进行的比较分析实验、2001年FELIS[19]对干酪乳杆菌及相近菌种看家基因recA基因片段序列进行的比较分析实验的结果都支持DELLAGLIO的观点，即L.zeae(包含ATCC 15820及ATCC 393)应该归为独立菌种。该观点在2008年同样被ICSB的司法委员会[25-26]以违反命名法为理由拒绝。

5 Lactobacillus chiayiensis sp.nov.的提出

2018年HUANG等[29]首次发表文章提出了Lactobacilluschiayiensissp.nov.这一与干酪乳杆菌菌群关系密切的新种。HUANG等分别从台湾的牛粪和菲律宾的椰子汁中分离出2株菌NCYUAST和BCRC 18859(=NRIC 1947)，并采用了全基因组测序、3种看家基因(dnaK,pheS和yycH)比对分析和RAPD-PCR分析等多种方法对其进行鉴定。鉴定结果表明，NCYUAST和BCRC 18859是相同菌株，它们是属于干酪菌群的新菌种，HUANG等将这一新种命名为Lactobacilluschiayiensissp.nov.，指定NCYUAST作为该菌种的模式菌株，并在文章中对该菌种进行了描述。

6 Lactobacillus(乳杆菌属)的分类变化

2020年，ZHENG等[30]通过对乳杆菌属(Lactobacillus)的261个菌种的核心基因的系统发育学研究、菌种之间的平均核苷酸一致性(average nucleotide indentity,AAI)比较、特征基因分析及菌种的生理学标准和生态学分析，提出将乳杆菌属重新分为25个属，其中包括乳杆菌属和23个新的属，同时建议将明串珠菌科(Leuconostocaceae)中的一个属划分到乳杆菌科(Lactobacillaceae)。根据这项研究，干酪乳杆菌群中的Lactobacilluscasei、Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei、Lactobacillusparacaseisubsp.tolerans、Lactobacillusrhamnosus、Lactobacilluschiayiensis分别更名为Lacticaseibacilluscasei、Lacticaseibacillusparacaseisubsp.paracasei、Lacticaseibacillusparacaseisubsp.tolerans、Lacticaseibacillusrhamnosus、Lacticaseibacilluschiayiensis，其中乳杆菌属包含了许多重要的益生菌资源，其分类的变化可能会影响到各国微生物相关行业法规的更新和菌种的应用。

7 结论

干酪乳杆菌(L.casei)的提出及其相近菌种的分类争议长达一个世纪，其分类方法经历了从开始的表型分析到现在的多种分子生物学鉴定方法，到2020年，干酪乳杆菌经重新分类并更名为Lacticaseibacilluscasei(干酪乳酪杆菌)[30]，其模式菌株依旧是ATCC 393。而副干酪乳杆菌(L.paracasei)也更名为Lactobacillusparacasei，其模式菌株为ATCC 25302，并保留了Lacticaseibacillusparacaseisubsp.paracasei、Lacticaseibacillusparacaseisubsp.tolerans两个亚种。研究表明仅通过表型分析和16S rRNA基因系统发育分析都无法将干酪乳杆菌群准确鉴定到种，需要多种方法相互结合，特别是全基因组测序技术和菌种之间的平均核苷酸一致性分析。基于全基因组序列分析和系统发育的分类鉴定技术的应用，将有助于干酪乳杆菌的科学分类。随着未来分子生物学和分类学方法的不断进步，干酪乳杆菌及其相近菌种的分类可能依旧会发生变化[31-39]。

干酪乳杆菌及相近菌种作为重要的益生菌资源，长期以来不仅是在酸奶，发酵乳饮料的生产、益生菌制品等食品领域应用广泛[40-42]，而且近年来在微生物药品开发、畜牧业[43]也得到了越来越多的应用。干酪乳杆菌及其相近菌株的科学分类不仅有助于我们正确认识菌种之间的进化关系，而且对于益生菌类保健食品的规范也有着重要影响。例如，在国家食品药品监督管理局2005年颁布的《益生菌类保健食品申报与审评规定(试行)》[44]中，可用于保健食品的益生菌菌种名单包含了L.caseisubsp.casei这一亚种，而在现在的干酪乳杆菌分类中已无该亚种的存在。