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焦磷酸测序技术对肠促胰素作用相关基因的SNP位点分型

2020-08-27施爱明钱晨月赵奉伦苏存锦潘杰

中国老年学杂志 2020年16期
关键词:多态性抑制剂位点

施爱明 钱晨月 赵奉伦 苏存锦 潘杰

(苏州大学附属第二医院,江苏 苏州 215004)

胰岛素的分泌受餐后血糖水平升高的刺激,也受肠促胰素效应的调控,在健康者中,肠促胰素效应负责大约70%的餐后胰岛素分泌,对正常机体的血糖调节过程起着重要作用。然而生理性肠促胰素在分泌后1~2 min内即被二肽基肽酶(DPP)-4降解失活,DPP-4 抑制剂通过抑制DPP-4 对活性肠促胰素的水解作用,增加活性肠促胰素的水平而改善血糖控制,是治疗2型糖尿病(T2DM)的新靶点〔1,2〕。临床使用过程中发现,DPP-4抑制剂的疗效存在个体差异,决定DPP-4抑制剂治疗反应的因素目前尚未完全阐明,个体遗传基因差异可能是影响DPP-4抑制剂疗效反应原因之一。研究发现,T2DM患者普遍存在肠促胰素效应减弱,可能原因包括肠促胰素分泌减少、DPP-4降解肠促胰素活性升高及肠促胰素受体信号转导通路受损等;因此参与肠促胰素合成、降解和作用通路的相关基因的遗传变异成为研究 DPP-4抑制剂疗效差异的靶点〔3~7〕。

本研究拟对编码胰高血糖素样肽受体(GLPIR)基因的rs3765467位点和抑胃肽受体(GIPR)基因的rs10423928位点、肠促胰素合成通路中TCF7L2基因的rs7903146位点、影响DPP-4酶活性的rs4664443和rs12617656位点,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增联合焦磷酸测序技术建立单核苷酸多态性(SNPs)的检测方法,并验证其准确性和可行性,为研究肠促胰素作用相关基因的SNP与DPP-4抑制剂疗效的相关性奠定基础。

1 对象与方法

1.1对象 选择2018年1~6月苏州大学附属第二医院就诊的口服DPP-4抑制剂的T2DM患者35例,其中男27例,女8例,平均年龄为(55.6±14.7)岁。

1.2仪器与试剂 凝胶成像系统和水平电泳槽(上海Bio-Rad公司);PCR扩增引物和焦磷酸测序引物合成(上海生工生物有限公司);血液基因组DNA提取试剂盒(美国Magen公司);PCR扩增试剂盒(日本Takara公司);美国ABI Veriti96 PCR仪(美国ABI生物系统公司);PyroMark Q24焦磷酸测序仪和焦磷酸测序试剂盒(德国Qiagen公司)。

1.3基因组 DNA的提取采用DNA提取试剂盒进行35例T2DM患者的全血DNA提取,并进行质量检测和纯度鉴定,确保每份DNA浓度大于30 μg/μl,提取后DNA样本置于-20℃保存备用。

1.4引物设计 在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上分别下载rs3765467、rs10423928、rs7903146、rs4664443及rs12617656这5个SNP位点所在的基因序列,采用PyroMark Assay Design Software2.0(德国Qiagen公司)设计PCR引物和测序引物。5个SNP位点引物见表1。

表1 rs7903146,rs12617656,rs4664443,rs3765467和rs10423928引物序列

1.5PCR扩增 PCR总反应体积为50 μl,包括:Ex Taq HS 0.25 μl,10×Ex Taq缓冲液5 μl,dNTPmix 4 μl,上下游 PCR引物各1 μl,基因组DNA 5 μl,RNase-free water 33.75 μl。PCR条件:98℃ 15 min,98 10 s,60℃ 30 s,72℃ 60 s,共循环35个周期,循环结束后72℃10 min。所有PCR产物应用1%的琼脂糖凝胶电泳进行进一步的分析和鉴定。

1.6焦磷酸测序分型检测 取8连管,每管加入80 μl反应体系,包括磁珠1 μl,结合缓冲液40 μl,PCR产物15 μl,高纯水24 μl。1 400 r/min室温振荡10 min。打开真空泵,将真空预备工具在高纯水中清洗30 s,移到8连管的孔中抽吸样品,捕获带有PCR 产物的亲和素包被的磁珠。依次用70%乙醇、变性缓冲液、清洗缓冲液冲洗10 s,关闭真空开关,将真空预备工具置入预加有0.4 μmol/L 测序引物(10 μmol/L测序引物1 μl和退火缓冲液24 μl)的焦磷酸测序(PSQ)24孔板中,轻轻晃动,释放亲和素包被的磁珠。将PSQ 24孔板置于预热好的板架上,80℃加热2 min、室温平衡2 min后,置于焦磷酸测序仪内进行测序。通过PyroMark Q24 软件对结果进行分析。

1.7Sanger测序验证 将这35例临床样本提取的DNA送苏州金唯智生物有限公司采用 Sanger测序法检测,进行SNP的二轮验证,保证上述所建焦磷酸分型检测方法的准确性。

2 结 果

2.1PCR结果 凝胶电泳结果显示,5个SNP位点的PCR产物均在相应位置呈单一条带,见图1,扩增特异性好。

M:Marker,1.患者1,2.患者2图1 2例患者5个SNP位点PCR产物凝胶电泳结果

2.2焦磷酸测序与Sanger测序结果 对35例患者5个SNP位点的基因多态性进行了焦磷酸测序,检测信噪比高,非特异峰的比例均在 10%以内,多态位点基因型可清晰判断,检测成功率100%。为了验证方法的准确性,同时采用Sanger测序技术对上述患者的 5个 SNP位点进行测序,测序结果见图2~6,分型结果见表2。两种方法的基因分型结果完全一致,35例患者5个SNP位点的突变比例与已报道的文献结果相接近〔5,8-10〕。

A.焦磷酸反向测序;B.Sanger反向测序,下图同图2 rs3765467多态性典型测序

图3 rs10423928多态性典型测序

图4 rs7903146多态性典型测序

图5 rs4664443多态性典型测序

图6 rs12617656多态性典型测序

表2 35例患者SNP位点基因型焦磷酸测序结果〔n(%)〕

3 讨 论

经过引物设计筛选和对PCR的退火和循环等扩增条件优化,最终5个SNP位点可以在相同的条件下进行扩增,非特异性扩增产物少,PCR扩增特异性好。焦磷酸测序是一种基于DNA序列的酶联级联测序技术,被广泛应用于基因多态性检测、甲基化检测及微生物鉴定等领域〔11~14〕,本文所建焦磷酸测序方法检测信噪比高,非特异峰低,多态位点基因型可清晰判断,检测成功率100%。

文献报道韩国人GLPIR基因rs3765467位点突变纯合型比率仅为2.8%〔5〕,本文检测到突变纯合型比率与文献报道的中国人群突变纯合型比率(15.3%)相近〔8〕。Meta分析结果显示GIPR基因rs10423928位点携A碱基突变与患者糖代谢异常相关〔6〕,本研究与NCBI中dbSNP公共数据库报道的频率一致。TCF7L2基因rs7903146位点为近期研究热点,许多研究显示rs7903146位点与多种疾病发生存在相关性,Meta分析结果显示rs7903146位点的多态性与进展为T2DM风险相关〔15〕。本文结果未检测到纯合型突变,与李云〔9〕报道的200例福建籍汉族人群检测结果一致,说明此位点在中国人群发生突变的比例较低。DPP-4基因rs12617656位点野生型、杂合型和突变纯合型比例与文献报道一致〔5〕。DPP-4基因rs4664443位点野生型、杂合型和突变纯合型比例与邢晓敏〔10〕报道的中国人群的结果一致。

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