吴旭锦，朱小甫，熊忙利，张文娟，尚红梅，杨 萍

(1.咸阳职业技术学院 畜牧兽医研究所，咸阳市动物疫病分子生物学诊断技术研究重点实验室，陕西 咸阳 712000；2.咸阳市动物疫病预防控制中心，陕西 咸阳 712000)

鸽疱疹病毒(Pigeonherpesvirus,PiHV)在分类上属于疱疹病毒科，但目前为止尚未归入亚科和属[1]。鸽子是PiHV的自然宿主，有报道长尾小鹦鹉能够感染，鸡、鸭、金丝雀对PiHV有抵抗力[2]。鸽自然感染表现为精神萎靡，采食下降，以结膜炎和鼻炎为特征，对鸽群健康危害较大，PiHV感染导致鸽群死淘增加，带来了一定的经济损失[3]。近年来，我国肉鸽消费量急剧上涨，赛鸽竞翔活动参与越来越广泛，鸽子的饲养量迅速增长[4～7]。但长期以来，学界对鸽疱疹病毒感染研究资料缺乏，对该病的病原基因特征、诊断方法、防控措施等方面研究薄弱[8]。本课题组从临床发病鸽群中分离到1株PiHV，进行了基因特征分析，以期为临床防控PiHV感染提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 组织病料主要包括肝脏、脾脏、肾脏及肺脏，采集自陕西省咸阳市某赛鸽爱好者饲养的鸽群疑似PiHV感染病例。

1.1.2 SPF鸡胚 SPF鸡蛋，北京梅里亚维通实验动物技术有限公司生产，本课题组自行孵化鸡胚，用于病毒分离。

1.1.3 试剂 DNAiso、RNAiso、rTaq酶、dNTP等分子生物学试剂，购自大连宝生物；pGEM-T easy载体克隆试剂盒，购自Promega公司；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，购自上海生工；DH5ɑ大肠埃希菌由咸阳市动物疫病分子生物学诊断技术研究重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank公开的PiHV基因序列KX589235/NC034266，针对UL30基因设计了1对引物，UL30-F：5’-GCTGTGTTTCGATATCGAGTGC-3’， UL30-R：5’-TCCAGCAAGACGGCCTGATC-3’，预期扩增片段1 326 bp。引物由上海生工合成，用DEPC处理水稀释到20 μmol·L-1工作浓度，用于PiHV UL30基因序列扩增分析。

1.2.2 病例观察 2019年4月，陕西省咸阳市某赛鸽爱好者饲养的赛鸽发病，课题组进行了临床诊断并进行了病理解剖，无菌操作采集组织病料备用。

1.2.3 病料处理与常见病原检测 将采集的组织样品加约5倍体积灭菌生理盐水剪碎，研磨呈糊状，10 000 g离心10 min，取上清液-70 ℃保存备用。采用课题组建立的新城疫、H9禽流感、传染性喉气管炎、传染性鼻炎PCR /RT-PCR检测方法进行检测，排查常见呼吸道病原感染情况。

1.2.4 病毒分离 给处理好的组织病料上清液加入双抗，至终浓度含青霉素、链霉素各2 mg·mL-1，室温静置30 min。选择9日龄SPF鸡胚，尿囊腔途径接种上清液0.2 mL，恒温恒湿培养箱中继续孵化，每8 h照胚一次。24 h内死胚弃去，收获死亡鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜，孵化4 d后仍未死亡鸡胚冻死后收获。研磨收获的绒毛尿囊膜，10 000 g离心5 min，收上清液。按照上述方法连续传代直至鸡胚出现规律性死亡。

1.2.5 传代病毒UL30基因PCR扩增 按照DNAiso试剂说明提取DNA。PCR扩增体系：DNA溶液 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，UL30-F、UL30-R各0.5 μL，rTaq酶0.5μL，超纯水补足至总体积25.0 μL。PCR程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循环35次；最后72 ℃延伸7 min。取5.0 μL产物电泳后成像系统中观察。

1.2.6UL30基因克隆测序与分析 按照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明将获得的DNA片段纯化，连接pGEM-T easy载体，转化感受态细胞，培养后挑取单个菌落，37℃摇动培养12 h，PCR鉴定阳性后提取质粒，酶切鉴定后测序，将获得序列和参考序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 病鸽临床症状、剖检变化以及常见病毒检测

病鸽咳嗽、甩鼻，鼻孔有黏液，结膜潮红。剖检发现，鸽子口腔有大小不一的黄色干酪团块附着；肺脏充血；肝肿，被膜紧张，表面有白色坏死区域；胰腺稍肿、潮红。其他脏器无肉眼可见变化。NDV、AIV H9、ILTV、副鸡嗜血杆菌PCR /RT-PCR检测均为阴性。

2.2 病毒分离结果

尿囊腔接种连续传代至第3代后，鸡胚接种48-72h集中死亡。剖检可见胚体皮肤有点状出血，肝脏肿胀，边缘钝圆，被膜紧张，颜色发黄并有坏死区或坏死点。

2.3 传代病毒UL30基因PCR扩增结果

对收获的尿囊液、绒毛尿囊膜进行病毒PCR扩增，电泳结果表明从样本中成功扩增出了1326bp的目的条带(图1)，证实病毒分离成功，命名为XY2019株。

2.4 UL30基因测序与分析结果

回收UL30基因片段，连接pGEM-T easy载体，构建质粒并酶切鉴定，结果显示酶切片段大小符合预期结果(图2)。

鉴定正确的阳性质粒测序后成功获得了XY2019株1 326 bp长度的UL30基因片段，利用DNAStar软件，将获得序列与GenBank中已知参考序列比对，同源性结果见图3，系统发生树见图4。

GenBank中PiHVUL30基因参考序列仅有4株，参考序列BJ株分离于中国北京市，登录号KC544263，来源于鸽；HLJ株分离于中国黑龙江省，登录号KX589235，来源于野鸽；S-18株分离于墨西哥，登录号NC024450，来源于猎鹰；登录号AF141890无毒株名，分离于德国，来源动物未提供。图3中，XY2019株UL30基因与这4株参考序列同源性在99.9%～100%之间。图4显示，比对序列形成2个大分支，XY2019、HLJ、S-18、BJ株处在一个分支上，而AF141890单独在一个分支上。

3 讨论

PiHV是一种鸽群重要的病原，最早于1936年在猎鹰体内分离成功[9]，但迄今学界对其研究仍极为有限。赵盼盼[10]分离了野鸽疱疹病毒HLJ株，并克隆了UL27基因，进行了序列变异分析。薛媚等[11]参考GenBank公开的PiHV基因信息，设计检测引物，优化了PCR反应条件，建成了一种PiHV PCR诊断方法，并进行了临床应用诊断。笔者研究首先通过PCR/RT-PCR方法排除了新城疫、H9禽流感、传染性喉气管炎、传染性鼻炎等有呼吸道症状传染病感染的可能性，然后利用PiHV能感染9-11日龄鸡胚的特点，通过SPF鸡胚连续3次传代，成功从赛鸽病料中分离到了PiHV野毒株XY2019株。通过PCR技术成功扩增了XY2019株UL30基因1 326 bp片段，序列比对分析表明，该毒株与和参考序列高度同源，这4株参考毒株分离时间、地域跨度很大，提示无论是来源于不同动物种类、不同分离国家或地区的PiHV UL30基因均高度保守，遗传性高度稳定。基因进化树显示，参比毒株形成2个大分支，XY2019、HLJ、S-18、BJ株处在一个分支上，而AF141890单独在一个分支上，表明该毒株遗传进化上与其他毒株存在一定差异。由于对PiHV基因序列研究尚不充分，公开的基因序列过少，尚不能构建精细的进化图谱。笔者研究分离成功XY2019株，为进一步研究毒株全基因序列、开发快速诊断方法、疫苗研究奠定了物质基础。