薛晶晶，刘兆宁，郭臣臣，申雨肖，楚建周，姚晓芹

河北大学生命科学学院（保定 071002）

油菜素内酯（BR）是一种生理活性极强的新型甾醇类植物激素，在促进植物生长发育、提高抗逆性、延缓衰老等方面具有积极作用。油菜素内酯可以促进光合产物的运输，使植物组织内部的细胞壁松弛从而促进伸长[1]。有研究证明，喷施适宜浓度的油菜素内酯可显著降低番茄的畸形果率；显著增加富贵竹单叶片的干鲜重和叶面积，增加富贵竹的株高、节间数和茎粗并增强其抗氧化活性[2-3]。林竹等[4]发现，肥城桃果树的硬核期叶面喷施0.10 mg/L油菜素内酯能显著增加肥城桃采收果实中的可溶性固形物、可溶性糖、蔗糖含量，提高果实品质。

芽苗菜作为一种由植物种子或其他贮藏营养的器官培育而成的、生长周期短、生产方法简易的幼嫩绿色蔬菜，品种繁多[5]。植物种子中的活性成分会在发芽过程中发生变化，如萝卜苗中的总酚、总黄酮含量较其种子的总酚、总黄酮含量成倍地增加，且产生了槲皮素[6]，从而使芽苗菜的营养价值提高，受到广大消费者的青睐[7]。余碧霞[8]指出，香椿发芽144 h后，香椿芽体内的总硒和有机硒含量随着Na2SeO3溶液浸种浓度（2～10 mg/L）的增加而显著增加。另有研究发现，喷施适宜浓度的GA3（500 mg/L）溶液可显著提高萝卜芽苗菜的产量[9]。刘晨霞等[10]报道，经90 mg/L乙烯利浸泡8 h后的绿豆在发芽第4天收获时具有更好的外观品质和产量。可见，探究外源化学物质对芽苗菜生长及品质改善的作用已成为关注热点。

针对油菜素内酯对芽苗菜品质影响的研究报道较少，因此以常见的芽苗菜品种——小黑豆为试材，探究不同浓度油菜素内酯浸种对小黑豆芽苗菜生理特性及品质的影响，旨在说明外源油菜素内酯对小黑豆芽苗菜生长的作用，为生产中提高小黑豆芽苗菜的品质以及油菜素内酯的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验以内蒙扁粒黄芯小黑豆为供试品种（购于保定市农资科技市场），培养成苗后分别在采收当天去掉小黑豆芽苗菜的根部，一部分保存在-80 ℃冰箱中，供生理参数测定；另一部分105 ℃杀青5 min，于56 ℃烘干至恒重，粉碎，过60目筛，混匀备用。

1.2 主要试剂与仪器设备

芸苔素内酯（72962-43-7，上海安谱实验科技股份有限公司）、无水乙醇、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、苯丙氨酸、硫酸等均为分析纯。

紫外可见分光光度计（WFZ UV-2800H型，尤尼柯上海仪器有限公司）；电子天平（BSA124S，赛多利斯科学仪器北京有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；智能人工气候箱（RXZ型，宁波江南仪器厂）；数控超声波清洗器（PS-40A型，240 W，深圳市康洁洗净电器有限公司）；低温离心机（Multifuge 1S-R D-37520 Osterode made in Germany）。

1.3 试验方法

1.3.1 芽苗菜培养

挑选饱满度好、无残损的小黑豆种子，分别用种子体积2倍的0.01，0.20，0.50，1.00，1.50和2.00 mg/L油菜素内酯溶液在室温下浸种24 h，以蒸馏水浸种作对照。浸种结束后捞出种子，沥去多余水分，整齐摆放在铺有3层湿纱布的平底托盘中，每个处理重复4次，每个重复200粒，置于23 ℃、相对湿度80%人工气候箱中，先黑暗催芽2 d，待苗高2 cm左右调成正常光照（12 h光照、12 h黑暗），光照强度4 000 Lux。适时补充水分并每天变换托盘位置，待小黑豆子叶半展、尚未平展，真叶微露时采收。

1.3.2 指标测定方法

1.3.2.1 光合色素含量

参考张以顺等[11]的方法并进行适当修改。称取0.2 g新鲜子叶剪碎，用8 mL 80%丙酮黑暗浸提3 d，期间振荡几次。取上清液，以80%丙酮为参比，分别于分光光度计663，646和470 nm下测定溶液的OD值。

1.3.2.2 花青素含量

称取0.2 g剪碎的新鲜茎，加5 mL 0.1 mol/L HCl于32℃恒温箱中避光浸提6 h，于530 nm下测定过滤后浸提液的OD值。OD值0.1时的花青素浓度称为1个单位[12]。

1.3.2.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

在张欣等[13]的测定方法上稍作修改。称取0.3 g剪碎的子叶，在冰浴的研钵中加5 mL硼酸缓冲液（含5 mmol/L巯基乙醇）研磨，4 ℃以10 000 r/min离心15 min，上清液就是酶的粗提液。取3 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸底物和50 μL酶液混匀，30 ℃恒温水浴锅中保温0.5 h，加0.5 mL 6 mol/L HCl终止反应，摇匀后于290 nm下测定反应液的OD值。

1.3.2.4 总酚含量

参考Peng等[14]的方法进行测定。称取0.2 g剪碎的茎，用5 mL酸化甲醇（V甲醇∶V盐酸=99∶1）于暗处浸提，每天振荡1次，3 d后于280 nm下测定提取液的OD值。

1.3.2.5 可溶性糖含量

采用蒽酮比色法[12]。称取0.1 g干样品于试管中，用5 mL蒸馏水沸水浴提取10 min，冷却后以8 000 r/min离心15 min，上清液转入刻度试管中；其残渣用水重复提取1次，合并上清液，用蒸馏水定容至15 mL。取0.1 mL提取液、0.9 mL 80%乙醇、1 mL蒸馏水及5 mL蒽酮试剂，混匀后煮沸10 min，迅速冷却，测定反应液在625 nm下的吸光度。

1.3.2.6 维生素C含量

参考张明晶等[15]的方法进行测定。称取0.2 g干样，用8 mL 1%草酸超声提取30 min，以8 000 r/min离心5 min，将上清液转入25 mL刻度试管中，用1%草酸稀释至刻度，混匀。取10 mL稀释液加入0.2 g活性炭振荡1 min，过滤。将5 mL滤液和5 mL 2%硫脲混匀，取4 mL该液加入1 mL 2% 的2,4-二硝基苯肼，混匀后于37 ℃保温3 h，取出后放冰水中，将5 mL 85%硫酸缓慢滴入试管（同时振荡试管），完毕后将试管置于室温静置30 min，于500 nm下测定溶液的OD值。

1.3.2.7 游离氨基酸含量

采用茚三酮比色法[11]测定。称取0.1 g干样，加8 mL的10%乙酸浸泡过夜，超声提取30 min，以8 000 r/min离心5 min。取2 mL上清液加入3 mL水合茚三酮溶液、0.1 mL 0.1%的抗坏血酸，振荡均匀后沸水浴15 min，取出冷却并摇动，待红色褪去呈蓝紫色时，用60%乙醇定容至20 mL，于可见光570 nm处测定溶液的吸光度。

1.3.2.8 黄酮含量

采用AlCl3比色法[16]测定。称取0.2 g干样，加入5 mL 50%乙醇浸提12 h，超声提取30 min后过滤，将滤渣过滤1次，合并滤液，用50%乙醇定容至25 mL。吸取5 mL定容液，加入8 mL 1.5% AlCl3、4 mL乙酸缓冲溶液，再用50%乙醇定容至25 mL，混匀后静置30 min，于分光光度计415 nm下测定反应液的OD值。

1.4 数据处理

运用SPSS 20.0版软件及Microsoft Excel 2010对试验数据进行处理并作图。

2 结果与分析

2.1 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜光合色素含量的影响

由图1可知，与对照相比，低浓度油菜素内酯处理（0.01～0.2 mg/L）显著提高小黑豆芽苗菜中叶绿素含量，并且在浸种浓度0.2 mg/L时小黑豆芽苗菜中叶绿素含量最大（0.682 1 mg/g FW）。这与黄蕾[17]在谷子和肖瑞雪等[18]在牡丹上的研究结果相似。结果表明，适量油菜素内酯浸种能够提高小黑豆芽苗菜的光合能力。然而，在试验条件下，高浓度油菜素内酯处理（0.5～2.0 mg/L）与对照相比显著降低小黑豆子叶中叶绿素含量。刘长英等[19]研究表明，ABA和乙烯利处理也显著降低桑椹中叶绿素含量，说明激素对叶绿素的合成有调控作用。高浓度油菜素内酯处理可能诱导一种胁迫环境，从而抑制黑豆芽苗菜中叶绿素合成。

图1 不同浓度油菜素内酯对小黑豆芽苗菜总叶绿素含量的影响

类胡萝卜素分布在叶绿素附近，保护其免受光氧化损伤[20]。试验条件下，高浓度油菜素内酯处理（0.5～2.0 mg/L）与对照相比显著降低小黑豆子叶中类胡萝卜素含量（图2）。表明高浓度油菜素内酯抑制小黑豆子叶中类胡萝卜素的合成，这可能是导致高浓度油菜素内酯处理下小黑豆芽苗菜中叶绿素含量降低的主要原因。

图2 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜类胡萝卜素含量的影响

2.2 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜苯丙氨酸解氨酶活性的影响

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物次生代谢过程中苯丙烷途径的关键酶[21]。与对照相比，低浓度的油菜素内酯处理（0.01～0.2 mg/L）对小黑豆芽苗菜中PAL活性没有显著影响。然而，高浓度油菜素内酯（0.5～2.0 mg/L）显著提高了小黑豆芽苗菜中PAL活性，油菜素内酯浓度1.0 mg/L时PAL活性最强[580.575 9 U/（g·h FW）]（图3）。试验结果表明，适当浓度的油菜素内酯可提高小黑豆芽苗菜的PAL活性。这与马立娜等[22]在葡萄上的研究结果相似。进一步证明高浓度油菜素内酯能够促进植物的次生代谢过程。

图3 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜苯丙氨酸解氨酶活性的影响

2.3 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜可溶性糖、游离氨基酸、维生素C含量的影响

图4 表明，与对照相比，低浓度的油菜素内酯（0.01和0.2 mg/L）显著降低小黑豆芽苗菜中可溶性糖含量，高浓度油菜素内酯处理显著提高小黑豆苗菜中可溶性糖含量，并且油菜素内酯质量浓度1.5 mg/L时小黑豆芽苗菜中可溶性糖含量达到最大值（33.508 mg/g DW）。

图4 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜可溶性糖含量的影响

小黑豆芽苗菜中游离氨基酸含量随着浸种浓度的升高呈现出先上升后下降趋势（图5）。与对照相比，油菜素内酯处理均显著提高小黑豆芽苗菜中游离氨基酸含量（2.0 mg/L除外），且在质量浓度为0.5 mg/L时芽苗菜中游离氨基酸含量达最高值（589.624 μg/g DW）。逆境诱导植物体内的糖类和蛋白质变成可溶性化合物增加[23]，所以可溶性糖和游离氨基酸不仅是果蔬中的营养成分，还是果蔬遭受渗透胁迫时产生的渗透调节物质。试验结果显示，小黑豆芽苗菜中可溶性糖含量在0.5～2.0 mg/L浓度处理时较高，这与相应浓度油菜素内酯对PAL活性的影响一致。

图6表明，0.01～0.5 mg/L油菜素内酯浸种处理下小黑豆芽苗菜中维生素C含量显著高于1.0～2.0 mg/L处理下小黑豆苗中维生素C含量。然而，李洪波等[24]研究指出，喷施1.0和2.0 mg/L油菜素内酯会显著增加火龙果果实中维生素C含量，而喷施低浓度BR（0.25和0.50 mg/L）时，果实中维生素C含量会显著降低。这可能是因为油菜素内酯对维生素C的作用效果不仅与物种有关，还与施加方式有关。

图5 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜游离氨基酸含量的影响

图6 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜维生素C含量的影响

2.4 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜黄酮、花青素、总酚含量的影响

植物体黄酮是一种重要的抗氧化活性成分。由图7可知，小黑豆芽苗菜中黄酮含量随着浸种浓度升高而增加，并在质量浓度2.0 mg/L时达最大值（1.751 g/100 g DW）。谢琳淼等[25]研究不同油菜素内酯喷施（0，0.1，0.4和0.8 mg/L）对蓝莓果实中黄酮的影响，结果表明，低质量浓度（0.1 mg/L）和高质量浓度（0.8 mg/L）油菜素内酯处理与对照相比对蓝莓中黄酮含量没有显著影响，然而0.4 mg/L油菜素内酯显著提高蓝莓果实中总黄酮含量。试验条件下，不同浓度油菜素内酯浸种处理与对照相比均显著地提高小黑豆芽苗菜中总黄酮含量。在高浓度油菜素内酯处理下小黑豆芽苗菜中黄酮含量与PAL活性和花青素含量呈显著正相关。

花青素是一种广泛存在于植物中的水溶性色素，其合成起始于苯丙氨酸，是黄酮和黄烷酮的衍生物，具有抗氧化、预防心血管疾病等作用[26-27]。由图8可知，与对照相比，油菜素内酯（0.01和0.5 mg/L除外）显著提高小黑豆芽苗菜中花青素含量，并且油菜素内酯质量浓度为2.0 mg/L时，小黑豆芽苗菜中花青素含量最高（2.273 A/g FW）。这与蔡丛希等[28]在萝卜芽菜中研究结果一致。然而，Loreti等[29]研究发现，GA处理对拟南芥中花青素的合成没有显著影响。表明激素对花青素的影响可能与品种、激素种类和浓度相关。另外，刘长英等[19]发现，桑椹发育过程中花青素含量与叶绿素含量的变化呈负相关关系。试验也表明，油菜素内酯处理下小黑豆芽苗菜中花青素含量与叶绿素含量呈负相关关系。

图7 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜黄酮含量的影响

图8 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜花青素含量的影响

植物多酚是植物体内多羟基酚类化合物的总称，具有抗氧化活性[30]，能保护植物细胞免受氧化损伤。图9显示，与对照相比，不同浓度油菜素内酯浸种均可显著增加小黑豆芽苗菜中的总酚含量（0.01 mg/L除外），且在质量浓度为1.0 mg/L时芽苗菜中总酚含量达最大值（10.102 A/g FW）。该结果与冯晓雪[31]在红地球葡萄上的研究结果一致。Guo等[32]报道，6-BA、NAA和GA3处理不仅显著提高黄豆芽菜中总酚含量，也显著提高GmPAL，GmCHS andGmIFS的表达水平。结果表明，外源植物激素可以调控植物体内酚类化合物的生物合成过程。试验中油菜素内酯可能也诱导酚类化合物主要合成基因高表达，从而促进总酚积累。

图9 油菜素内酯对小黑豆芽苗菜总酚含量的影响

3 结论

试验表明，外源油菜素内酯浸种处理可以有效提高小黑豆芽苗菜的品质，但是各成分对油菜素内酯浓度（0.01～2.0 mg/L）的反应并不一致。试验条件下，低浓度油菜素内酯处理（0.01～0.2 mg/L）能够显著提高小黑豆芽苗菜中叶绿素、类胡萝卜素、氨基酸、维生素C、黄酮、花青素（0.01 mg/L除外）和总酚（0.01 mg/L除外）含量，然而却显著降低小黑豆芽苗菜中可溶性糖含量。高浓度油菜素内酯处理（0.5～2.0 mg/L）显著提高小黑豆芽苗菜中PAL活性和可溶性糖、氨基酸（2.0 mg/L除外）、黄酮、总酚和花青素含量（0.5 mg/L除外）。并且，高浓度处理下小黑豆芽苗菜中总酚、花青素、黄酮、可溶性糖含量显著高于低浓度油菜素内酯处理下芽苗菜中含量。