姚明奇 ，向鹏程，戴余军 ，王艳树，汤新金，斯琴朝克图 *

1.湖北工程学院生命科学技术学院（孝感 432000）；2.湖北省植物功能成分利用工程技术研究中心（孝感 432000）；3.湖北省孝感市公共检验检测中心（孝感 432000）；4.湖北省孝感市农业技术推广中心（孝感 432000）

据报道，自2017年开始，国内白酒产量逐渐下降，因此许多商家选择保健酒作为突破口，进行大规模生产、销售。到2018年为至，国内酒厂4万多家，其中3千多家生产保健酒[1]。2012年保健酒市场规模130亿元左右，总销量超出100万 t，保健酒行业正以年均30%的增速高速发展。保健酒市场成长为继白酒、葡萄酒和啤酒之后，国内酒业的第四大市场。但是由于缺乏标准，保健酒饮用安全问题遭到消费者的广泛质疑。因此，中国酒业协会于2019年2月1日起批准实施T/CBJ 5101—2019《保健酒》团体标准。新标准首次明确定义了保健酒的概念，并规定保健酒应取得保健食品批号或备案。保健酒定义为以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为基酒，加入符合国家有关规定的原料、辅料或食品添加剂，经注册或备案，并声称具有保健功能的饮料酒。它适用于特定人群食用，有调节机体的功能，但不以治疗为目的，并且对人体不产生任何急性、亚急性或慢性危害[2]。

食品和饮品中的微量元素组成和含量对消费者和健康护理专业人员而言都是非常重要的参考数据。人体内的必需有益元素在体内调节着各种生理功能，并与人体的健康状况有着千丝万缕的联系。但极微量重金属有毒元素会严重损害健康甚至致死。因此，在食品及食品工业生产中严格控制其含量。微量元素铜（Cu）、铁（Fe）、钙（Ca）、镁（Mg）、锌（Zn）、锰（Mn）等元素都是人体所必需的微量有益元素，在人体的酶系、氧化代谢、生长发育、防御调控、信息传递等生理过程中发挥着不可替代的作用。但同时这些微量元素在人体内大量蓄积时会导致慢性中毒，极易对身体内的脏器造成负担，特别是肝脏和肾脏等器官，从而导致人体内的新陈代谢出现紊乱，影响人体健康[3-5]。镉（Cd）元素毒性较大，是人体非必需元素，在人体内代谢、排泄速度缓慢，半衰期长，在世界上被称为第三大有害金属[6]。葡萄酒等有色酒中的微量元素来源可能与其生产区域、添加原材料、土壤、当地气候、原材料的耕种方式、酵母、酿造工艺、运输和储存方式和时间，甚至与生产设备相关[7-9]。

微量元素检测方法有电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法、电感耦合等离子体发射光谱（ICPOES）法，火焰原子吸收（F-AAS）法和电热原子吸收光谱（ET-AAS）法等[10-15]。其中火焰原子吸收法在国内应用最广泛、操作方法简便，而且无论检测费用还是仪器设备购买费用都相对较低，检测方法易于推广。如果样品前处理方法简单，试剂易得，一般实验室里都可完成相关检测。因此，建立一种经过简单的混酸湿法消解，采用火焰原子吸收分光光度法测定有色保健酒中Cu、Fe、Ca、Mg、Zn、Mn和Cd等7种微量元素的检测方法，并选择市场常见的有色保健酒和暂未上市的有色保健酒作为检测对象，验证检测方法的可行性，为食品安全监控提供操作简单、安全、费用低、有效且可靠的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

日立ZA-3000火焰原子吸收光谱仪（配钙、镁、锌、铁、铜、镉、锰空心阴极灯，日立高新技术有限公司）；恒温电热板（上海科信电子科技有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；Direct-Q3超纯水系统（美国密理博（Millipore）公司）；JOYN-30AL型智能超声波清洗机（上海乔跃电子有限公司）；常用玻璃仪器在使用前均于盐酸与硝酸混合液中浸泡过夜，在超声波清洗器中洗净，用去离子水冲洗3次备用。

1.2 药品与试剂

有色酒样（千古一方，武汉唐乐生物科技股份有限公司）；劲酒（湖北省黄石市劲牌有限公司）。

单元素标准溶液（国家有色金属及电子材料分析测试中心）：Ca（1 000 μg/mL，GSB 04-1720-2004）、Fe（1 000 μg/mL，GSB 04-1726-2004）、Mg（1 000 μg/mL，GSB 04-1735-2004）、Cd（1 000 μg/mL，GSB 04-1721-2004）、Mn（1 000 μg/mL，GSB 04-1736-2004）、Zn（1 000 μg/mL，GSB 04-1771-2004）、Cu（1 000 μg/mL，GSB 04-1725-2004）。

硝酸（分析纯，德国默克股份两合公司）；盐酸（分析纯，德国默克股份两合公司）；高氯酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氧化镧（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；等。

各元素标准使用液（200 μg/mL）：用移液器准确吸取10 mL各元素标准溶液于50 mL容量瓶中，用0.5 mol/L硝酸定容至刻度（Ca和Mg用5%稀盐酸），混匀。

各元素标准加标使用液（10 μg/mL）：用移液枪准确吸取1.25 mL 200 μg/mL标准使用液于25 mL容量瓶中，用0.5 mol/L硝酸定容至刻度（钙和镁用5%稀盐酸），混匀。

镧溶液（20 g/L）的配制：准确称取23.45 g氧化镧，先用少量水润湿，然后再加75 mL盐酸（1+1）充分搅拌至完全溶解，冷却至室温，转移至1 000 mL容量瓶，用超纯水定容至刻度，混匀。

硝酸+高氯酸（4∶1）：用量筒准确量取200 mL浓硝酸和50 mL高氯酸充分搅拌混匀。

5%盐酸溶液：用量筒准确量取50 mL浓盐酸，将其缓慢加入到适量的水中稀释，将该溶液定容至1 000 mL，混匀。

0.5 mol/L硝酸：用移液管准确吸取32 mL浓硝酸，将其缓慢加入到适量水中稀释，定容至1 000 mL，混匀。

盐酸（1+1）：用量筒准确量取50 mL浓盐酸，将其缓慢加入到适量的水中稀释，定容至100 mL，混匀。

1.3 样品制备

准确量取10 mL保健酒样品置于清洁干燥的250 mL锥形瓶中，于通风橱中在60～80 ℃恒温电热板上，去除样品中的酒精及醇类物质。观察瓶底剩余液体1～2 mL时取下置于桌面以余温蒸发至1 mL左右。待其冷却至室温后加入10 mL预先配制好的混酸消解液（硝酸+高氯酸，4∶1），在通风橱中置于140～160℃的恒温电加热板上，并在锥形瓶口放置一个小漏斗。加热消解过程中保持样品微冒泡但不可沸腾，时刻观察瓶内样品混合液的颜色，发现有颜色加深现象需立刻添加适量消解液以防止碳化。一直加热消解至锥形瓶内底部凸起，边缘剩余少许液体约2 mL且溶液澄清透明冒出大量白烟时停止加热，取下冷却至室温后加入3 mL去离子水继续加热消解，直到有少许白烟，且瓶底约2 mL时取下以余温蒸干至1 mL左右。冷却至室温后，每次加入少量0.5 mol/L硝酸溶液进行冲洗，钙和镁的测定组用5%稀盐酸冲洗，共冲洗5次后转移至50 mL容量瓶中，同时加入2.5 mL 20 g/L的镧溶液，最终用超纯水定容至刻度，备用。其中每个样品平行处理3份，每份平行测定3次，做全程空白试验。用0.45 μm的微孔滤膜过滤待测。空白样品进行同样处理，待测。

1.4 标准曲线的绘制

分别准确量取各元素标准使用液（200 μg/mL），配制成质量浓度梯度分别为0，0.5，1.0，1.5和2.0 μg/mL的钙和锰标准系列溶液；0，0.2，0.4，0.6和0.8 μg/mL的铁标准系列溶液；0，0.2，0.4，0.8和1.2 μg/mL的铜标准系列溶液；0，0.2，0.4，0.8和1 μg/mL的镉标准系列溶液；0，0.05，0.10，0.15和0.20 μg/mL的镁标准系列溶液；0，0.1，0.2，0.3和0.4 μg/mL的锌标准系列溶液。其中，钙和镁用5%盐酸定容，其余元素均用0.5 mol/L硝酸定容。以1% HNO3或5%盐酸作空白对照，由稀到浓依次测定系列标准溶液吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.5 准确度与精密度

向酒样中加入适量10 μg/mL各元素标准溶液，使各元素浓度分别为20，60和180 μg/L。采用1.3小节中方法制备，用原子吸收分光光度仪检测，回收率采用单点校正法计算。同1 d内每个浓度5个平行，计算日内相对标准偏差，每种样品重复5 d，计算日间相对偏差。检测时加标前样品作为空白对照，减除背景值，计算其回收率。

回收率=[加标液浓度（μg·L-1）/空白样品浓度（μg·L-1）]/加标液浓度（μg·L-1）×100% （1）

2 结果与分析

2.1 定量分析方法学验证

2.1.1 仪器最佳工作条件

通过不同元素的特性及仪器的参考推荐值，灯电流在5～12.5 mA的推荐范围内选取5.0，7.5，10.0和12.5 mA常用值依次测试，燃烧器高度在5～12.5 mm范围内选用5.0，7.5，10.0和12.5 mm常用值测试，狭缝宽度在0.2，0.4和1.3 nm范围内测试，其他条件均采用仪器推荐固定值，根据不同条件下的吸光度，确定每种元素在工作范围内的最佳测定值。结果表明，在表1所示设定值条件下仪器运行稳定，回收率和精密度可靠，获得的测定值均能满足测样条件。

表1 仪器最佳工作条件

2.1.2 标准曲线与线性关系

在表1所示条件下对Cu、Mn元素标准溶液进行测定。每个试样平行重复3次，取其平均值，并绘制标准曲线。各元素线性回归方程和相关系数见表2。结果表明，各元素在设定浓度范围之内有着良好线性关系和相关性，满足定量分析要求。

2.1.3 仪器检出限

空白消解液在表1所示条件下依次检测，平行重复3次，所得吸光度平均值代入回归方程，结果的3倍值作为检测限。得到结果：Ca 6.00 μg/L，Mg 0.00 μg/L，Zn 0.00 μg/L，Fe 13.00 μg/L，Cu 3.00 μg/L，Mn 2.00 μg/L，Cd 3.00 μg/L。

表2 各元素标准曲线回归方程与相关系数

2.1.4 回收率与精密度

2种有色保健酒中不同元素添加回收率见表3。结果表明，7种元素在2种有色保健酒中回收率在85.08%～109.58%之间，RSD为0.13%～4.82%，均可满足定量分析方法需要。

表3 元素在保健酒中加标回收率（n=3）

2.2 有色保健酒中7种元素含量测定

采用湿法消解2种有色保健酒中7种元素总含量，结果见表4。结果表明，所选保健酒劲酒中各元素浓度顺序为Ca＞Mg＞Fe＞Cu＞Zn＞Mn＞Cd；在千古一方保健酒中的各元素浓度顺序为Ca＞Mg＞Mn＞Fe＞Zn＞Cu＞Cd。其中，钙元素含量最高，镉元素含量最低。2种酒相比较，千古一方保健酒中的各元素含量均比劲酒高。

表4 保健酒中7种元素含量（n=3）

3 讨论与结论

保健酒成分复杂，原料来源多样，对产品的质量监控带来较为严重的影响，极易产生不确定的多种干扰。保健酒中金属元素可能来自白酒基酒、各种中药材、包装材料等。其中，某一环节出现不符合规范，则会引入不确定的杂质，使酒中的成分含量以及风味品质发生变化。其次商品中加入的柠檬酸、香精、防腐剂、酒的颜色等都会对检测方法产生干扰。因此，建立有色保健酒中的微量元素检测方法过程中，要根据样品特性选择合适的前处理方法，最大程度消除干扰，保证检测方法的稳定性和可靠性。

在现有文献报道和国标方法[6,16-26]的基础上，选择尝试5种前处理方法：（1）取10 mL样品于100 mL容量瓶中稀释后直接进样；（2）取10 mL样品首先在电热板上蒸发除去乙醇及酯类物质，转移至100 mL容量瓶并用去离子水定容，进样；（3）取10 mL样品，蒸发去除乙醇及酯类物质，转移至100 mL容量瓶并用0.5 mol/L硝酸定容，进样；（4）取10 mL样品，蒸发去除乙醇及酯类物质后加入10 mL浓硝酸消解，进样；（5）取10 mL样品，加热蒸发去除乙醇及酯类物质后加入10 mL浓硝酸和高氯酸（4∶1，V/V）的混酸置于恒温电热板上消解，直至剩余1～2 mL且澄清透明，冷却至室温用，0.5 mol/L硝酸定容，进样。经过多次试验，发现方法（1）的试样中含有较多的悬浮颗粒，体系颜色过深，不仅会堵塞进样管道而且颜色会极大影响检测结果。进一步将试样过滤后测定，其回收率较低。原因主要是未经过处理，试样背景指数高，在测定波长处干扰物质过多。方法（2）和（3）相比与方法（1），试样中悬浮物颗粒减少，颜色也变浅。但是稀硝酸定容体系中存在的酸性环境使得部分元素测得吸光度较大，还存在较大的基质干扰，所测吸光度飘忽不定，稳定性较差。方法（4）的消解基本上能将有机物质消解完全，但仍然存在一定的颜色干扰，且很难通过增加消解液的量来彻底消除，影响结果的准确度。另外，那海秋等[27]用不同前处理方法处理并测定保健食品中钙元素时对比发现，干法消解过程中受环境影响比较大，周期长，不利于多样品平行处理分析。湿法消解过程中因空气中的干扰物质污染，造成试样测量误差，且样品加热时受热均匀导致碳化等问题。而微波消解相对简单可靠，密闭环境受外间环境干扰较少，所需试剂量少，周期短，利于大批量同时处理测定且批次之间回收率及重现性好。周雅兰等[28]用微波消解法处理测定啤酒中多种微量元素，获得满意结果。根据文献报道和多次尝试后发现，方法（5）的混酸湿法方法可大批量处理样品，且操作简单易行。但是在实际操作过程中发现整个过程消耗试剂多，费时，有时样品消解不完全。因此，试验在此方法基础上以简化步骤、细化操作精度作为重点，进行进一步优化。主要改进的步骤：消解时取小型漏斗置于锥形瓶口增加瓶内温度及形成回流，让消解液蒸发速度减慢，消解过程更彻底，可避开富集处理；对于钙、镁、锌、铁活泼的碱金属元素，为避免基质干扰，选择使用镧溶液；进样前的试样过滤方法改为静置几分钟，既避免试样中少量针状晶体造成进样管道堵塞，又消除过滤导致的交叉污染和试样损失。

试验结果表明，建立的有色保健酒中7种微量元素定量分析方法的前处理过程简便易行，不用富集，可大批量同时处理。所用试剂均是实验室常备试剂，检测费用低，操作安全。最低检测限为0～13.00 μg/L；标准曲线线性范围广，相关系数为0.999 4～0.999 9；回收率为85.08%～109.58%，RSD为0.13%～4.82%，均可满足定量分析方法学要求。方法所用仪器为火焰原子吸收分光光度仪，具有选择性好、灵敏度高、简单易操作、抗干扰能力强等优点，可直接快速检测。所选2种有色保健酒中的7种元素中Ca和Mg含量较高，Cd含量最低。