张海弢，付娟，杨晓筱，李曼曼，范业文

江苏康缘药业股份有限公司（连云港 222001）

涵睿胶囊是由红景天、姜黄、葡萄籽提取物等制成的一款具有增强免疫力功能的保健食品，适用于免疫力低下的人群。红景天苷是红景天的主要活性成分，研究发现红景天苷在增强免疫力方面具有明显的保健功能[1-3]。山柰酚、槲皮素作为黄酮类化合物主要活性成分，研究表明其对机体免疫功能具有增强作用。姜黄素类化合物是双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的统称，作为中药材姜黄中的有效成分，大量研究结果显示，其对适应免疫、固有免疫均有增强作用[4-8]。

测定复方产品中多种有效活性成分比单一指标成分测定，具有快速、准确、可靠的特点，且更加科学、全面地表征产品质量[9-13]。试验采用小粒径色谱柱，基于多波长快速同时测定涵睿胶囊中红景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素8种有效成分，该检测方法快速、准确、可靠；采用薄层色谱法对姜黄提取物和葡萄籽提取物进行定性鉴别，方法可行，专属性强。试验旨在建立涵睿胶囊定性定量评价方法，以期快速、全面、有效地评价其内在质量，为从多指标、多成分角度提升涵睿胶囊质量控制水平提供研究参考，为全面控制其质量提供依据。

1 仪器和材料

Agilent 1260 HPLC色谱仪，DAD紫外检测器（美国安捷伦科技公司）；ZF-20D三用紫外分析仪（上海越众仪器设备有限公司）；Mettler XP6、Mettler AE240型电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Centrifuge 5415D高速离心机（德国艾本德公司）；Milli-Q超纯水机（美国密理博公司）；KQ-250DB型超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）。色谱级乙腈（美国天地公司）；硅胶G薄层层析板（青岛海洋化工厂分厂、青岛胜海精细硅胶化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、烟台市化学工业研究所）。

红景天苷（批号110818-201708，质量分数以98.8%计），姜黄素（批号110823-201405，质量分数以98.9%计），山柰酚（批号110861-201310，质量分数以93.2%计），酪醇（批号111676-200602），双去甲氧基姜黄素（批号112004-201501，质量分数以95.0%计），槲皮素（批号100081-201509，质量分数以98.6%计），去甲氧基姜黄素（批号112003-201501，质量分数以98.5%计），姜黄对照药材（批号121188-201304）均购自中国食品药品检定研究院；香豆素（批号MUST-18040901），原花青素（MUST-14081604）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；涵睿胶囊（批号20171101、20171102、20171103、20171201、20171202，江苏康缘药业股份有限公司）；超纯水；甲醇等试剂，除特殊说明，所用试剂均为分析纯。

2 HPLC含量测定

2.1 色谱条件

以Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）为色谱柱；流动相为乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脱（0～10 min，10%～30%乙腈，10～15 min，30%～45%乙腈，15～30 min，45%～65%乙腈）；流速1.0 mL/min；检测波长275 nm（红景天苷、香豆素、酪醇），370 nm（槲皮素、山柰酚）和430 nm（姜黄素、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素）；柱温30℃；进样量10 μL，理论板数按红景天苷峰计算，不低于6 000。见图1。

图1 HPLC图谱

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称定适量红景天苷、姜黄素、山柰酚、酪醇、去甲氧基姜黄素、香豆素、槲皮素、双去甲氧基姜黄素对照品，加50%甲醇制成含红景天苷104.95 mg/L、姜黄素137.8 mg/L、山柰酚103.37 mg/L、酪醇70.87 mg/L、去甲氧基姜黄素78.54 mg/L、香豆素76.09 mg/L、槲皮素90.05 mg/L、双去甲氧基姜黄素147.54 mg/L混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取10粒涵睿胶囊，去壳，内容物研细，混匀，取1.000 0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，称定其质量，超声提取30 min，冷却后再称定其质量，补足失重，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

取2.2小节的混合对照品溶液，进行等比例稀释，注入HPLC色谱仪，测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），以对照品的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得线性回归方程。结果见表1。

表1 8种成分的线性关系

2.5 定量限考察

将红景天苷等8种有效成分对照品溶液逐步稀释后进样，以信噪比（S/N）为10时考察其定量限，结果显示红景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的定量限分别为0.033，0.063，0.068，0.068，0.065，0.045，0.031和0.043 mg/kg。

2.6 精密度试验

取涵睿胶囊（批号20171101）去壳，内容物研细，混匀，按照2.3小节的方法制备供试品溶液，2.1小节的色谱条件连续进样6针，以峰面积计算8种有效成分RSD值。结果显示红景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素的RSD值分别为0.56%，0.41%，0.47%，0.21%，0.35%，0.19%，0.27%和0.56%，结果表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取涵睿胶囊（批号20171101）去壳，内容物研细，混匀，取1.0 g，精密称定，按照2.3小节的方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按照2.1小节的色谱条件分别于0，2，6，10，14，18和24 h注入液相色谱仪，以峰面积为指标计算8种有效成分的RSD值。结果显示红景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的RSD值分别为0.33%，0.24%，0.18%，0.26%，0.15%，0.40%，0.22%和0.39%。结果表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.8 重复性试验

取涵睿胶囊（批号20171101）去壳，内容物研细，混匀，取1.0 g，精密称定，按2.3小节的方法平行制备6份供试品溶液，计算8种有效成分的含量。结果显示红景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素含量分别为0.026，0.018，0.019，0.022，0.026，0.036，0.019和0.034 mg/kg；RSD值分别为0.41%，0.52%，0.26%，0.44%，0.35%，0.28%，0.49%和0.24%，结果表明方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取涵睿胶囊（批号20171101）去壳，内容物研细，混匀，取0.5 g，取9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，3份1组，分别精密加入0.5，1.0和1.5 mL混合对照品溶液（红景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素质量浓度分别为1.282，0.853，0.987，1.135，1.198，1.758，0.961，1.673 mg/mL），精密加入25 mL 50%甲醇，超声提取30 min，冷却后摇匀，高速离心，取上清液，即得。测定，计算回收率。结果显示红景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的平均回收率分别为99.0%，98.7%，98.5%，99.3%，99.7%，99.8%，99.7%和100.2%；RSD分别为0.67%，0.66%，0.86%，0.56%，0.74%，0.65%，0.75%和0.96%。2.10 样品测定

3 TLC鉴别

3.1 姜黄提取物

取3批涵睿胶囊，各20粒，除去胶囊壳，内容物研细，取0.2 g粉末，加20 mL无水乙醇，振摇，放置30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加2 mL无水乙醇使溶解，即得供试品溶液。取0.2 g姜黄对照药材，同法制成对照药材溶液。另取姜黄素对照品，加无水乙醇制成每1 mL含0.5 mg溶液，即得对照品溶液。分别吸取供试品溶液、对照品溶液和对照药材溶液，各1 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，条带状点样，条带宽度4 mm，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）为展开剂，展开，取出，晾干，分别置日光和紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，结果见图2。

表2 8种有效成分含量测定结果（n=2）

图2 涵睿胶囊中姜黄提取物TLC图谱

3.2 葡萄籽提取物

取3批涵睿胶囊，各20粒，除去胶囊壳，取0.5 g粉末于三角瓶中，加30 mL甲醇，超声处理30 min，过滤，滤液置通风橱中自然挥干，残渣加5 mL甲醇使溶解，即得供试品溶液。取5 mg原花青素对照品于2 mL量瓶中，加甲醇制成每毫升含2.5 mg原花青素溶液，即得对照品溶液。分别吸取6 μL供试品溶液、对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%香草醛盐酸溶液，置于日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，结果见图3。

图3 涵睿胶囊中葡萄籽提取物TLC图谱

4 结论与讨论

涵睿胶囊经50%甲醇提取后，在190～600 nm波长范围内通过DAD检测器进行全波长扫描，结果显示红景天苷、香豆素和酪醇在波长275 nm有较强紫外吸收，山柰酚和槲皮素在波长370 nm有较强紫外吸收，姜黄素、双去甲氧基姜黄素和去甲氧基姜黄素在波长430 nm有较强紫外吸收。通过考察不同的提取方法、提取时间和提取溶剂用量，确定涵睿胶囊有效成分测定试验供试品溶液制备方法。考察4种不同流动相（甲醇-水、甲醇-0.5%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸）对8种待测有效成分的影响，流动相乙腈-0.5%甲酸系统所得图谱中各色谱峰的分离情况和峰形较好，故选择乙腈-0.5%甲酸作为流动相；比较了使用Waters symmetry C18、Phenomenex Luna C18和Kromasil C18的3种不同品牌种色谱柱，结果显示3种色谱柱无明显差异。比较柱温25，30和35 ℃，流速0.8，1.0和1.2 mL/min，结果无明显差异。方法学验证试验结果表明红景天苷13.15～420.89 mg/L、酪醇12.54～401.12 mg/L、香豆素13.61～435.36 mg/L、槲皮素13.62～435.88 mg/L、山柰酚12.94～414.20 mg/L、双去甲氧基姜黄素17.93～573.64 mg/L、去甲氧基姜黄素12.32～394.32 mg/L、姜黄素17.02～544.52 mg/L，呈良好线性关系，8个成分的平均回收率分别为99.0%，98.7%，98.5%，99.3%，99.7%，99.8%，99.7%和100.2%；8种有效成分测定试验所采用的检测方法耐用性良好。

涵睿胶囊中姜黄提取物薄层鉴别试验，参考《中华人民共和国药典（一部）》2015年版姜黄药材鉴别项下TLC方法[14]制备供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液。考察3种不同展开剂三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）、二氯甲烷-丙酮-甲酸（96∶4∶0.7）和二氯甲烷-乙醇-甲酸（96∶4∶0.7），结果显示展开剂为三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）时，供试品在和对照品和对照药材溶液相同位置显相同颜色的斑点，斑点清晰，颜色鲜艳，分离度较好，且阴性无干扰，故选择三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）为展开剂；考察1，2，3和4 μL点样量，结果显示点样量1 μL时，斑点已清晰，且分离度较好，无明显差别，故确定点样量为1 μL。对研究方法的薄层板、温度、湿度进行考察，以确保方法的可靠性。结果显示不同湿度（40%±5%，60%±5%和80%±5%），温度在4 ℃和室温，不同厂家薄层板（青岛胜海精细硅胶化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青岛海洋化工厂分厂）条件下，均能得到良好的检视，说明方法专属性强，适合涵睿胶囊成品薄层色谱鉴别。

涵睿胶囊中葡萄籽提取物薄层鉴别试验，采用自主建立的方法，并作了方法学验证。考察3种不同展开剂甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）、二氯甲烷-甲醇-甲酸（3∶2∶1）、乙酸乙酯-甲醇（2∶1），结果显示展开剂为二氯甲烷-甲醇-甲酸（3∶2∶1）和乙酸乙酯-甲醇（2∶1）时，展开效果较差，无明显斑点，呈现一条色带，分离度不合格；展开剂为甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）时，供试品在和对照品溶液相同位置显相同颜色的斑点，斑点清晰，颜色鲜艳，分离度较好，且阴性无干扰，故选择甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）为展开剂；考察2，4，6，8和10 μL点样量，结果显示点样量为6 μL时，斑点清晰，故确定点样量为6 μL。对研究方法的薄层板、温度、湿度进行考察，以确保方法的可靠性，结果显示不同湿度（40%±5%，60%±5%和80%±5%），温度在4 ℃和室温，不同厂家薄层板（青岛海洋化工厂分厂、青岛胜海精细硅胶化工有限公司、烟台市化学工业研究所、青岛裕民源硅胶试剂厂）条件下，均能得到良好的检视，说明方法专属性强，适合涵睿胶囊成品薄层色谱鉴别。

综上所述，试验建立的质量评价方法稳定可靠、重现性好、专属性强，为从多指标、多成分角度提升涵睿胶囊质量控制水平提供参考。