王丹，时志春，李军，王金兰，张树军，赵明

齐齐哈尔大学化学与化学工程学院（齐齐哈尔 161006）

茶叶为山茶科植物茶（Camellia sinensis（L.）O.Ktze.）的芽、叶，其含有丰富的茶多酚、茶多糖、维生素及矿物质等营养物质，具有抗衰老、抗肿瘤、降血糖和降血脂等[1-3]功效，是天然酚类抗氧化剂的主要来源，能有效清除自由基，抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化能力[4]。茶多酚是从绿茶和红茶中提取的一种纯天然复合物，具有清除自由基、防止DNA受损、调节细胞内抗氧化防御系统及抗癌等生物学功能[5]。茶多酚中以儿茶素类为主要成分，具有显著的药理作用，茶多酚含量占茶叶干重的30%左右[6]。近十几年，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。

物质的总的抗氧化活性是指清除不同的自由基或者物质的不同活性成分的有效和[7]。国内外常用的测定总抗氧化活性的方法有DPPH法、ABTS法、ORAC法、FRAP法等。但是这些方法对于一些大规模的分析植物样品抗氧化活性，存在着实验步骤较多的缺点，因此开发了HPLC-DPPH法、铜离子在线检测（HPLC-CUPRAC）法、在线HPLC-ABTS+·法[8-10]等多种HPLC在线检测系统，可以高效快速地分析样品的抗氧化活性。但是这些在线检测法的重点是确定单体化合物是否具有抗氧化活性[11-13]，利用抗氧化活性综合指数（Antioxidant potency composite，APC）评价样品抗氧化能力[14]，并不能直接快速地换算成标准抗氧化物质当量来表示样品的总抗氧化能力大小，同时定性定量样品的总抗氧化活性。为了实现在线快速检测茶叶水提物的总抗氧化活性，此次试验建立一种利用在线HPLC-ABTS+·检测系统，快速高效地测定总混合物抗氧化活性的分析测定方法，并基于传统的离线DPPH自由基清除法评价，验证了利用在线HPLCABTS+·系统研究的实用性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶样品均为市售品：花茶（福建福州）；铁观音（福建安溪）；绿茶（西湖龙井；信阳毛尖）。水为娃哈哈纯净水。儿茶素标准品（美国Sigma公司，纯度98%以上）；ABTS（2,2′-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐）；DPPH（2,2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）；过硫酸钾（上海凌峰，分析纯）；无水乙醇（分析纯）；甲醇（山东禹王，色谱纯）。

1.2 仪器与设备

安捷伦1260在线高效液相色谱系统（配有二元梯度泵、ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、自动进样器、柱温箱、光电二极管阵列 DAD检测器）；柱后反应系统（配有柱后衍生单元泵、柱后反应线圈、三通、MWD多波长检测器）；Chemstation数据分析工作站（美国安捷伦公司）；RE-52B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；TGL-16G型高速离心机（江苏金坛市中大仪器厂）；BP 310S电子天平（赛多利斯公司）；酶标仪（瑞士Tecan sunrise）。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

每个茶叶样品经40 ℃干燥后，粉碎过60目筛，分别准确称取2.0 g茶叶粉末于250 mL圆底烧瓶中，加入100 mL纯净水，回流2 h，重复回流2次，冷却后过滤蒸干称重，制得的茶叶水提物于冰箱中4 ℃保存，备用。

1.3.2 溶液的配制

DPPH自由基溶液的配制：准确称取7.5 mg DPPH粉末于20 mL无水乙醇中，配制成质量浓度为0.375 mg/mL的DPPH溶液，在4 ℃冰箱中避光保存，备用。

ABTS+·溶液的配制：采用2 mmol的ABTS水溶液和3.5 mmol的K2SO4水溶液混合，用8倍体积的娃哈哈纯水稀释，室温避光保存，过夜后加入系统溶剂瓶中。

1.3.3 色谱条件

色谱柱为ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相A为甲醇；流动相B为水；流速为1.0 mL/min；梯度洗脱：0～5 min 25% A，5～10 min 25%～30% A，10～15 min 30%～40% A，15～20 min 40% A，20～30 min 40%～70% A；进样体积为10 μL；柱温为25℃；检测波长为210 nm；ABTS+·溶液流动相流速为0.5 mL/min；检测波长为734 nm。

1.3.4 样品抗氧化活性测定

1) HPLC-ABTS+·在线抗氧化活性测定。分别取不同茶叶提取物浸膏置于容量瓶中，配制成2.0，3.0和4.0 mg/mL甲醇溶液，离心后，用0.22 μm微孔滤膜过滤，将滤液置于棕色进样瓶中待测。将处理后的样品提取液按照1.3.3小节进行HPLC-ABTS+·在线系统分析，进样量为10 μL。柱后衍生分析系统参照文献[15]方法，ABTS+·溶液引入流速为0.5 mL/min，MWD检测器检测波长为734 nm。

2) DPPH自由基清除能力测定。自由基清除试验参照文献[16]的方法，设置2个试验组：空白组（A0），20 μL无水乙醇+180 μL DPPH溶液；样品组（A1），20 μL待测样品+180 μL DPPH溶液。分别取20.0 μL配制好的不同浓度的样品溶液至96孔板中，向其中分别加入180.0 μL的DPPH溶液，轻轻振荡，使其充分混合，避光反应30 min，用酶标仪在517 nm检测波长下测定各孔吸光度。各试验组设2个平行孔，重复试验3次。

2 结果与分析

2.1 儿茶素标准曲线

精密称取20.0 mg儿茶素标准品，用甲醇溶解定容至10 mL棕色容量瓶中，制成2.0 mg/mL标准溶液，用甲醇逐级稀释，制备2.0，1.5，0.75，0.375和0.062 5 mg/mL的标准溶液，并经0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶中，进样；记录检测波长为734 nm的倒峰面积。

用儿茶素的质量浓度（x）与其对应的色谱倒峰面积（y）绘制标准曲线，结果见图1。回归方程和相关系数为：y=14 594x+2 733.8（R2=0.999 1）。儿茶素在0.062 5～2.0 mg/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系。经HPLC测定，以信噪比（S/N）为3和10所对应样品中该物质的质量浓度分别计算检限测（LOD）和定量限（LOQ），儿茶素检测限检出限为0.2 μg/mL，定量限为1.0 μg/mL。利用儿茶素抗氧化当量（Catechin equivalent antioxidant capacity，CEAC）换算样品的总抗氧化活性测定值，从而实现分析样品的总抗氧化能力。

图1 儿茶素标准曲线

2.2 仪器精密度的考察

精密吸取10 μL 1.5 mg/mL的儿茶素对照品溶液，按上述测定条件连续进样5次，计算得儿茶素测定结果的相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD），为1.77%，精密度满足方法学定量要求。

2.3 重复性试验

精密称取同一批次茶叶样品，各5份，按照上述供试溶液的制备方法和测定条件，制备5份供试溶液并测定，对同一批次样品多次取样分析，RSD为1.98%，表明该方法具有良好的重现性。

2.4 基于HPLC-ABTS+·法测定不同茶叶提取物的总抗氧化能力分析

利用HPLC-ABTS+·系统已经测得的样品倒峰总面积代入儿茶素建立的标准曲线方程，将不同浓度样品抗氧化活性以儿茶素当量（Catechin equivalent antioxidant capacity，CEAC）表示，测试结果如表1所示，所得数值 CEAC 值越大，表示抗氧化能力越强。

由表1可知，由HPLC-ABTS+·法测定的4种茶叶抗氧化能力由大到小的顺序依次是花茶＞西湖龙井＞信阳毛尖＞铁观音。其中花茶的抗氧化能力表现最强，分析结果如图2所示；两种绿茶类茶叶抗氧化能力相当，且均强于乌龙茶类的铁观音。由图2可以看出，花茶在线系统反应后的倒峰较多且吸光度较大，铁观音的倒峰较少且吸光度较弱。

儿茶素是茶多酚最具生物活性的部分[17]，在发酵过程中，酚类氧化酶氧化儿茶素生成醌类，然后形成Bisflavanol、Thearubigen、茶黄素等物质[18]。随着发酵程度的加深，儿茶素含量迅速下降。表明发酵程度越高，抗氧化能力越低，这与其他文献报道的一致[19]。

2.5 DPPH法抗氧化活性验证

选用儿茶素作对照品，对4种茶叶用DPPH进行抗氧化活性验证试验。分别称取儿茶素及待测样品，配制成100，80，60，40和20 μg/mL五种不同的质量浓度，将配制好的待测样品及儿茶素加入到96孔细胞培养板的小孔中，在避光条件下再分别加入180 μL DPPH乙醇溶液到每个孔中，反应0.5 h后放入酶标仪中，96孔板反应液结果图如图3所示。

表1 待测样品的抗氧化活性

图2 花茶和铁观音的HPLC-ABTS+·在线抗氧化分析结果图

图3 不同茶叶样品DPPH抗氧化活性试验结果图

由图4可知，不同茶叶样品的DPPH自由基清除率均随质量浓度增加而增加，其清除能力比儿茶素略低。在517 nm的波长下测定吸光度，经计算得待测样品及儿茶素的IC50值。由表2可以看出，在DPPH自由基的反应体系中，各种茶叶样品对自由基的清除能力差异较大，其清除能力依次为儿茶素＞花茶＞西湖龙井＞信阳毛尖＞铁观音。

图4 不同茶叶样品对DPPH自由基清除率的影响

表2 样品及儿茶素抗氧化活性的IC50

3 结论

HPLC-ABTS+·在线抗氧化检测系统是指通过HPLC系统与柱后衍生系统连接起来，在线分析抗氧化活性，使样品提取物可以随着流动相被洗脱出来，并与另一个泵的ABTS+·自由基溶液反应，反应结果以自由基溶液色谱倒峰图体现。倒峰总面积越大，代表被清除的自由基越多，样品的总抗氧化活性越强。该方法样品自动进样，分析时间短，克服了离线抗氧化活性分析过程中操作过程繁琐、费时费力的缺点，减少了人为操作过程对实验结果的影响。

此次试验以不同茶叶为研究对象，采用在线HPLC-ABTS+·法证实茶叶提取物具有一定清除自由基能力，初步计算了抗氧化活性相当于标准抗氧化物质的当量值，同时与离线DPPH法测定提取物的总抗氧化活性进行比较，大小趋势基本一致。清除能力依次为儿茶素＞花茶＞西湖龙井＞信阳毛尖＞铁观音，该方法可用于植物资源总抗氧化活性系统的快速评价。